Linhagens secretoras de insulina, como a BRIN-BD11, são utilizadas para o estudo do mecanismo de secreção de insulina estimulado pela glicose (GSIS). Essas células expressam o GPR40, que quando ativado por ácidos graxos (AG), potencializam a GSIS. Considerando que as espécies reativas de oxigênio (EROs) podem estar relacionadas com a secreção de insulina mediada por AG, este estudo tem como foco avaliar se há envolvimento do GPR40 na GSIS e na produção de EROs, via NADPH oxidase (NADPHox), em células BRIN-DB11. A ativação do GPR40 foi feita com agonista GW9508 (GW). A secreção de insulina (SI), o conteúdo de superóxido (CS) e ativação da NADPHox foram analisados em resposta a glicose na presença ou ausência de GW (20mM). O envolvimento da NADPHox no CS induzido pelo GW foi analisado após inibição da NADPHox. O aumento da concentração de glicose paralela com aumento da SI, causa redução no CS. A presença do GW potencializa a SI em altas concentrações de glicose, aumenta o CS, e aumenta a translocação da subunidade p47phox do plasma para a membrana. Com a inibição da NADPHox o efeito do GW não ocorre. Os dados confirmam um efeito positivo do GPR40 na secreção de insulina estimulada pela glicose. O GW ativa a NADPHox resultando em um aumento do CS nas células BRIN-BD11. / BRIN-BD11, an Insulin secreting cell line, are used to study the mechanisms of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). These cells express GPR40, which is activated by fatty acids (FA) and potentiates GSIS. Considering that reactive oxygen species (ROS) is a signal that modulates insulin secretion (IS) induced by FA, this study aimed to investigate the involvement of GPR40 in ROS production, via NADPH oxidase (NADPHox), and in GSIS. To activate the GPR40 its agonist, GW9508 (GW), was used. IS and superoxide production (SP) were analyzed in response to increasing glucose concentrations (IGC), with or without GW (20mM). The activation of NADPHox was analyzed. The involvement of NADPHox on SP induced by GW was also evaluated using a small interference RNA or using the NADPHox inhibitor, VAS2870 (12mM). The presence of GW potentiated the IS at high glucose concentrations, together with an increased effect on SC. This increase was paralleled by an increase in the translocation of p47phox to the plasma membrane. Moreover, the inhibition of NADPHox abolished the GW9508 effect. These results show a positive effect of the GPR40 activation in GSIS. Additionally, GW9508 activates NADPHox resulting in an increase in the SC in BRIN-BD11 cells.

Linhagens secretoras de insulina, como a BRIN-BD11, são utilizadas para o estudo do mecanismo de secreção de insulina estimulado pela glicose (GSIS). Essas células expressam o GPR40, que quando ativado por ácidos graxos (AG), potencializam a GSIS. Considerando que as espécies reativas de oxigênio (EROs) podem estar relacionadas com a secreção de insulina mediada por AG, este estudo tem como foco avaliar se há envolvimento do GPR40 na GSIS e na produção de EROs, via NADPH oxidase (NADPHox), em células BRIN-DB11. A ativação do GPR40 foi feita com agonista GW9508 (GW). A secreção de insulina (SI), o conteúdo de superóxido (CS) e ativação da NADPHox foram analisados em resposta a glicose na presença ou ausência de GW (20mM). O envolvimento da NADPHox no CS induzido pelo GW foi analisado após inibição da NADPHox. O aumento da concentração de glicose paralela com aumento da SI, causa redução no CS. A presença do GW potencializa a SI em altas concentrações de glicose, aumenta o CS, e aumenta a translocação da subunidade p47phox do plasma para a membrana. Com a inibição da NADPHox o efeito do GW não ocorre. Os dados confirmam um efeito positivo do GPR40 na secreção de insulina estimulada pela glicose. O GW ativa a NADPHox resultando em um aumento do CS nas células BRIN-BD11. / BRIN-BD11, an Insulin secreting cell line, are used to study the mechanisms of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). These cells express GPR40, which is activated by fatty acids (FA) and potentiates GSIS. Considering that reactive oxygen species (ROS) is a signal that modulates insulin secretion (IS) induced by FA, this study aimed to investigate the involvement of GPR40 in ROS production, via NADPH oxidase (NADPHox), and in GSIS. To activate the GPR40 its agonist, GW9508 (GW), was used. IS and superoxide production (SP) were analyzed in response to increasing glucose concentrations (IGC), with or without GW (20mM). The activation of NADPHox was analyzed. The involvement of NADPHox on SP induced by GW was also evaluated using a small interference RNA or using the NADPHox inhibitor, VAS2870 (12mM). The presence of GW potentiated the IS at high glucose concentrations, together with an increased effect on SC. This increase was paralleled by an increase in the translocation of p47phox to the plasma membrane. Moreover, the inhibition of NADPHox abolished the GW9508 effect. These results show a positive effect of the GPR40 activation in GSIS. Additionally, GW9508 activates NADPHox resulting in an increase in the SC in BRIN-BD11 cells.

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elise Tatiane Felipe.pdf: 1262841 bytes, checksum: 333a42d3fe5d2d900b4f4700830a76d7 (MD5) Previous issue date: 2011-04-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Diabetes mellitus is now a major public health problems, with increasing numbers of incidence, and has been considered an epidemic. Several studies demonstrate the relationship between diabetes mellitus and oxidative stress. Thus bioactive compounds with potential to act by preventing or mitigating the consequences of this process are interesting. In this category are the flavonoids, compounds with antioxidant activity is well established, marked by its reactive species scavenger capacity and thereby have the potential to act in the treatment or prevention of diabetes. Therefore, the objective was to evaluate the in vitro effects in the cytotoxic, cytoprotective and functionality of insulin-secreting cells BRIN-BD11 of the flavonoids rutin and hesperidin. The methods were used: MTT reduction method (assessment of cell viability), radioimmunoassay (assessment of insulin secretion), and the enzymatic rate method for determining the maximum activity of glutathione peroxidase (GSH-Px). The experiment of cytotoxicity was not observed cytotoxic effect of the flavonoids rutin and hesperidin in all tested concentrations (1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 and 80 μM) after 24 hours of treatment. The flavonoids rutin and hesperidin concentrations of 2.5, 5 and 10 μM showed no cytoprotective effects on BRIN-BD11 cells under oxidative stress induced by exposure to hydrogen peroxide (37.5 μM-sub-lethal and lethal-75 μM ). In this test the flavonoids and hydrogen peroxide were added simultaneously and remained in contact with the cells for 24 hours. BRIN-BD11 cells were pretreated (24 hours) with rutin and hesperidin (10 μM) and subsequently subject to oxidative stress induced by hydrogen peroxide (350 μM) for 2 hours. In this condition also was not observed cytoprotective effect of flavonoids. Rutin and hesperidin (1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 and 80 μM) had no insulinotropic BRIN-BD11 cells after 24 hours of treatment. After treatment BRIN-BD11 cells for 24 hours in the presence of the flavonoids rutin and hesperidin (10 μM) was not observed change in the activity of glutathione peroxidase (GSH-Px). Thus, it is concluded that the flavonoids rutin and hesperidin are safe, showing no cytotoxicity on BRIN-BD11 cells, but showed no cytoprotective effects and insulinotropic on the conditions tested. / O diabetes mellitus é hoje um dos grandes problemas de saúde pública, com números crescentes de incidência, e tem sido considerado uma epidemia. Vários estudos demonstram a relação do diabetes mellitus com o estresse oxidativo. Desse modo compostos bioativos com potencial para atuar impedindo ou amenizando as consequências deste processo despertam grande interesse. Nesta categoria estão os flavonóides, compostos com atividade antioxidante bem estabelecida, marcada pela sua capacidade de seqüestro de espécies reativas e desta forma com potencial para atuar no tratamento ou prevenção do diabetes. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro os efeitos citotóxicos, citoprotetores e na funcionalidade de células secretoras de insulina BRIN-BD11 dos flavonóides rutina e hesperidina. As metodologias utilizadas foram: método de redução do MTT (avaliação da viabilidade celular), radioimunoensaio (avaliação da secreção de insulina), e o método de cinética enzimática para a determinação da atividade máxima da enzima glutationa peroxidase (GSH-Px). No ensaio de avaliação da citotoxicidade não foi constatado efeito citotóxico dos flavonóides rutina e hesperidina em nenhuma das concentrações testadas (1,25; 2,5; 5; 10; 20; 40 e 80 μM) após 24 horas de tratamento. Os flavonóides rutina e hesperidina nas concentrações de 2,5; 5 e 10 μM, não apresentaram efeitos citoprotetores em células BRIN-BD11 sob estresse oxidativo induzido pela exposição ao peróxido de hidrogênio (37,5 μM- sub-letal e 75 μM- letal). Neste ensaio os flavonóides e o peróxido de hidrogênio foram adicionados simultaneamente e permaneceram em contato com as células por 24 horas. Células BRIN-BD11 foram pré-tratadas (24 horas) com os flavonóides rutina e hesperidina (10 μM) e posteriormente submetidas a estresse oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio (350 μM) por 2 horas. Neste ensaio também não foi verificado efeito citoprotetor dos flavonóides. Rutina e hesperidina (1,25; 2,5; 5; 10; 20; 40 e 80μM) não apresentaram efeitos insulinotrópicos em células BRIN-BD11 após 24 horas de tratamento. Após o tratamento das células BRIN-BD11 por 24 horas na presença dos flavonóides rutina e hesperidina (10 μM), também não foi verificada alteração na atividade da enzima glutationa peroxidade (GSH-Px). Desse modo, conclui-se que os flavonóides rutina e hesperidina são seguros, não apresentando citotoxicidade sobre células BRIN-BD11, entretanto, não apresentaram efeitos citoprotetores e insulinotrópicos nas condições testadas.