La virulence de Bordetella pertussis, agent de la coqueluche, est liée à un arsenal de facteurs de virulence dont l’expression est régulée par le système à deux composants BvgAS. BvgA est le régulateur de réponse et BvgS le capteur du système, qui possède 3 domaines putatifs de perception de signaux. Il s’agit de 2 domaines périplasmiques « Venus FlyTrap » (VFT), reliés par un segment transmembranaire à un domaine PAS (Per-ARNT-Sim) cytoplasmique qui fait la jonction avec l’histidine-kinase. Les signaux perçus par ces domaines capteurs sont inconnus, mais une température de 37°C est suffisante pour maintenir le système actif en laboratoire. Cette activité peut être modulée négativement par des composés chimiques, comme le MgSO4 ou le nicotinate, qui à concentrations suffisantes entraînent le passage de la bactérie en phase avirulente.Nous nous sommes intéressés aux domaines VFT de BvgS. Ces domaines, ubiquitaires, sont composés de 2 lobes reliés par une charnière délimitant une cavité qui permet la fixation d’un ligand spécifique stabilisant le VFT sous une forme fermée.Les domaines VFT de BvgS ont pu être cristallisés et s’organisent en un dimère entrelacé définissant de larges interfaces entre les 4 VFTs. Les VFT2 sont fermés sans ligand et les VFT1 ouverts, et la fermeture artificielle de ces domaines par des ponts disulfure a montré qu’il s’agit de la conformation active de BvgS. L’importance des interfaces entre les domaines VFT pour la fonction de BvgS a été démontrée par mutagenèse dirigée. Un signal positif proviendrait du périplasme pour être transmis à travers la membrane par les interfaces entre les VFT et intégré via un couplage fonctionnel en trans entre ces domaines et les hélices pré-membranaires, dites H19.Ces hélices se prolongeraient à travers la membrane et dans le cytoplasme jusqu’au domaine PAS. Les domaines PAS sont ubiquitaires, avec une structure fortement conservée en feuillet  à 5 brins recouvert d’hélices  délimitant une cavité. Ils sont impliqués dans diverses fonctions biologiques, selon leur capacité de liaison d’un ligand. Certains domaines PAS fonctionneraient sans ligand et pourraient servir d’adaptateurs ou d’amplificateurs de signal.Nous avons pu mettre en évidence la capacité de dimérisation de PASBvg, confirmant la nature dimérique du capteur BvgS. Des substitutions de résidus de la cavité de PASBvg indiqueraient que l’intégrité de la cavité de PASBvg est nécessaire au passage de signaux positifs et négatifs provenant du périplasme. La fixation de ligand dans la cavité n’a pu être démontrée mais n’est pas exclue. D’autre part, certains résidus sont nécessaires au couplage du domaine PAS avec ses hélices flanquantes pour la transmission de signal. La perte de ces interactions déstabilise significativement PASBvg et rend BvgS inactif.Un message positif proviendrait du périplasme et serait maintenu par le domaine PAS, dans une conformation rigide, permettant aussi la transmission des signaux modulateurs. / Virulence of Bordetella pertussis, the whooping cough agent, is due to a plethora of virulence factors which expression is regulated by the two-component system BvgAS. BvgA is a classical response regulator and BvgS the sensor. BvgS contains 3 putative sensor domains, 2 periplasmic Venus FlyTrap (VFT), linked through a transmembrane segment to a cytoplasmic PAS domain preceding the histidine-kinase. Signals perceived by those sensor domains are still unknown, but a 37°C temperature is sufficient to maintain the system active under laboratory conditions. This activity can be down-modulated by chemical compounds, such as MgSO4 or nicotinate, which at sufficient concentration allows the bacteria to switch to avirulent phase.We investigated the role of BvgS VFT domains. VFTs are ubiquitous domains composed of 2 lobes linked by a hinge hence forming a cleft where a specific ligand can bind and stabilize the VFT in its closed conformation.BvgS VFT domains were crystalized and form an intricate dimer defining large interfaces between the 4 VFTs. VFT2s are closed without a ligand and VFT1s are opened, artificial closure of these domains via a disulfide bond indicates that this is the active conformation of BvgS. The role of the interfaces was probed by site-directed mutagenesis. A positive signal might originate from the periplasm to be transmitted through the membrane by the interfaces and integrated by a functional coupling between the VFT2s and the helices preceding the membrane, H19.These helices should be continued through the membrane and the cytoplasm to the PAS domain. Pas domains are ubiquitous with a highly conserved structure, a 5 stranded sheet surrounded by  helices defining a cavity. Pas domains are involved in a wide variety of physiological processes, depending on their ability to bind a ligand. Some PAS might function without a ligand and could then be signal adaptors or amplifiers.We demonstrated PASBvg was dimeric, confirming the dimeric nature of BvgS. Cavity residues were substituted indicating that integrity of the cavity is necessary to maintain activity and modulation capacity coming from the periplasmic moiety. Ligand binding wasn’t demonstrated but couldn’t be excluded. Some residues are needed for the correct coupling of the PAS domain to its flanking helices and hence signal transmission. Loss of these connections generates a strong destabilization of PASBvg and turns BvgS inactive.A positive signal might come from the periplasmic moiety and shoul be maintaines by the PAS domain, which is in a rigid conformation also allowing the transmission of negative signals.

Bordetella pertussis est l’agent responsable de la coqueluche. Pour coloniser le tractus respiratoire humain, cette bactérie à Gram négatif, aérobie stricte, produit de nombreux facteurs de virulence dont l’expression est sous la dépendance du système à deux composants BvgAS. BvgS est un senseur-kinase dimérique. Chaque monomère est constitué de trois domaines putatifs de perception - deux domaines Venus flytrap périplasmiques et un domaine PAS cytoplasmique -, suivis du domaine enzymatique et deux autres domaines, de phospho-transfert et receveur, impliqués dans la cascade de phosphorylation. L’expression du régulon de virulence est activée suite à la phosphorylation par BvgS du régulateur de réponse BvgA. BvgS est en mode kinase à l’état basal, et la perception de basses températures ou de signaux chimiques comme les ions sulfate ou nicotinate cause son passage en mode phosphatase. L’étude présentée dans ce manuscrit vise à caractériser le senseur-kinase BvgS en analysant les domaines putatifs de perception ainsi que la transduction de signal qui s’effectue au sein de la molécule. L’étude de la portion périplasmique a permis de mettre en évidence, à l’état basal, un gradient de dynamique décroissant. En se fixant au domaine VFT2 proximal à la membrane, le nicotinate induirait une diminution de la dynamique du second lobe du VFT1, causée par la formation d’un bloc compact entre le domaine VFT2 et le deuxième lobe du domaine VFT1. Cette rigidification exercerait une tension sur les hélices α qui précèdent les segments transmembranaires, provoquant une transition de la portion cytoplasmique vers l’état phosphatase. La perception de modulateurs par le domaine VFT2 - ou possiblement la fixation d’un ligand dans la cavité du VFT1- modifierait cette dynamique et causerait le changement d’activité de BvgS. Ainsi, nous proposons un modèle dans lequel le VFT1 est considéré comme le moteur du système, lui impulsant une dynamique qui serait relayée ou atténuée par le domaine VFT2. Une recherche de ligands antagonistes pour le domaine VFT1 a été entreprise, selon l’idée que la fixation d’un ligand réduirait la dynamique de ce dernier. Au sein du dimère, des connecteurs prédits pour former des enroulements d’hélices α (‘coiled coil’) relient entre eux les domaines VFT et PAS, et les domaines PAS et kinase de BvgS. La transduction d’information entre les domaines périplasmiques et le site enzymatique de BvgS a été analysée par mutagénèse dirigée et ‘cysteine scanning’. Des contacts proches sont observés entre les hélices constituant le segment transmembranaire, qui ne semblent pas être modifiés après perception de modulateur. Nous suggérons donc un modèle de piston symétrique pour la transmission d’information au travers de la membrane. Le coiled coil putatif précédant le domaine PAS présente une certaine dynamique rotationnelle à l’état basal. La perception de modulateurs semble induire l’écartement de ces hélices, ce qui pourrait permettre un changement de l’interface des domaines PAS. L’étude de la topologie du domaine PAS confirme une modification de cette interface entre les modes kinase et phosphatase de BvgS. Enfin, le coiled coil reliant les domaines PAS et kinase est sujet à une forte dynamique rotationnelle à l’état basal, en accord avec un modèle de régulation de l’activité kinase proposé dans d’autres systèmes. Suite à la perception de modulateur, une rigidification marquée de ce coiled coil est observée, permettant le passage en mode phosphatase. L’existence de deux états dynamiques différents de ce coiled coil a également été mise en évidence en absence du domaine PAS.Ces études ont permis d’avancer dans la compréhension de BvgS et de proposer un modèle de la signalisation au sein de ce senseur-kinase, qui pourrait s’appliquer aux autres membres de la famille de BvgS. / Bordetella pertussis is the agent of an acute and highly contagious respiratory disease, whooping cough. In order to colonize the human respiratory tract, this strictly aerobic Gram negative bacterium produces many virulence factors, the expression of which is regulated by the BvgAS two-component system. BvgS is a sensor-kinase composed of three putative domains of perception –two periplasmic Venus flytrap domains and a cytoplasmic PAS domain -, followed by the enzymatic domain and two other domains called phosphotransfert and receiver involved in the phophorelay. The expression of the virulence regulon is activated after the phosphorylation by BvgS of the response regulator BvgA. BvgS is in a kinase mode at the basal state, and the perception of low temperatures or chemical signals like sulfate ions or nicotinate causes a shift to the phosphatase state. The study presented in this manuscript has focused on the characterization of the BvgS sensor-kinase. We have analyzed its putative domains of perception and the mechanisms of signal transduction.Investigations into the dynamics of the periplasmic moiety has provided evidence for a decreasing gradient of dynamics from N to C-terminus at the basal state. Nicotinate binding to the membrane-proximal VFT2 domains decreases the dynamics of the second lobe of VFT1. Tighter interactions between the latter and the VFT2 domain cause a tension on the α helices that precede the transmembrane segments, triggering the transition to the phosphatase state of the enzymatic portion. Perception of modulator by the VFT2 domains –or possibly binding of a ligand in the VFT1 cavity- thus appears to modify periplasmic dynamics, which shifts BvgS activity. We propose that the VFT1 domains are the motor for BvgS activity, and their dynamics are relayed or attenuated by the VFT2 domains. A search for antagonistic VFT1 ligands has been undertaken, along the idea that ligand binding may reduce their dynamics.The VFT and PAS domains, and the PAS and kinase domains are joined to each other by long α helices predicted to form coiled coils. We performed directed mutagenesis and cysteine scanning analyses to decipher signal transduction between the periplasmic domains and the enzymatic moiety of BvgS. The close contacts between the helices of the transmembrane segment are not modified after perception of the modulator, suggesting that signal transduction across the membrane is mediated by symmetrical piston motions. The putative coiled coil before the PAS domain shows rotational dynamics at the basal state. Modulator perception causes the helices to splay, and this motion may modify the PAS domains interface. Our topology analyses of the PAS domain confirm that changes occur at this interface between the kinase and phosphatase states of BvgS. Finally, the coiled coil between the PAS and kinase domains presents a strong rotational dynamics at the basal state, which is consistent with the model of regulation of kinase activity proposed for other sensor-kinases. After perception of a modulator, this coiled coil becomes more rigid, allowing the shift to the phosphatase state. The occurrence of two states of dynamics for this coiled coil has also been demonstrated in the absence of the PAS domain.These studies have advanced our understanding of BvgS and allow us to propose a model of signaling by this sensor-kinase, which may apply more broadly to other family members.