Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T17:33:23Z No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_LídiaMariadeAndrade.pdf: 11453373 bytes, checksum: 44afceab2d00fc571d9eff405707ed38 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T17:33:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_LídiaMariadeAndrade.pdf: 11453373 bytes, checksum: 44afceab2d00fc571d9eff405707ed38 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T17:33:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_LídiaMariadeAndrade.pdf: 11453373 bytes, checksum: 44afceab2d00fc571d9eff405707ed38 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-16T17:33:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_LídiaMariadeAndrade.pdf: 11453373 bytes, checksum: 44afceab2d00fc571d9eff405707ed38 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A radioterapia é uma modalidade importante para tratar o câncer de Cabeça e Pescoço, no entanto falhas do tratamento já foram observadas e recorrência da doença é comum. Novas abordagens para melhorar os efeitos benéficos de radioterapia têm sido desenvolvidas e terapia gênica surge como uma ferramenta importante para atingir esse objetivo. Apesar de modelos in vitro serem úteis para entender os efeitos da radiação em níveis celulares um modelo mais próximo ao esquema de irradiação clínica, que permita reproduzir irradiação diária, é necessário. Sinais de cálcio no núcleo têm demonstrado desempenhar um papel crucial em células de mamíferos por regularem a expressão de genes envolvidos na proliferação celular, e ja foi também demonstrado que o tamponamento de Ca2+ nuclear prejudica o crescimento das células cancerosas in vitro, bem como in vivo. O objetivo deste estudo foi desenvolver um protocolo in vitro que simulava radioterapia de cabeça e pescoço de acordo com parâmetros clínicos e investigar o papel do tamponamento de Ca2+ nuclear para aumentar o efeito antitumoral de raios-X em carcinoma de células escamosas humano. Para estes fins, células da linhagem celular A431 foram submetidas a dose acumulada de 10Gy de raios- X, em esquema de fracionamento diário de doses, (XRCd10Gy) ou em associação com o tamponamento de Ca2+ nuclear (Ca2+n). Análise do ciclo celular, ensaio de proliferação, a quantificação de lesões de DNA nuclear /mitocondriail, expressão de ADAM-17, a expressão de EGFR e fração de sobrevivência foram investigadas. Nosso modelo forneceu irradiações uniformes à monocamada de células, minimizando as incertezas, independente da posição dos frascos dentro de campo de irradiação, Todos os frascos receberam 100 ± 2% da dose calculada total. Descobrimos que XRCd10Gy induziu apenas 4,3 ± 0,3% de morte celular (SubG1), indicando radiorresistência. Após o tamponamento de Ca2+n a proliferação de células A431 diminuiu significativamente (p < 0,001) em comparação com o controle. Análise do ciclo celular mostraram que a associação do tamponamento Ca2+ n com XRCd10Gy aumentou a percentagem de células A431 em G2/M (35,7 ± 2,5 %), sem danos de DNA nucleares/mitocondrial aparentes. No entanto, o tamponamento de Ca2+n preveniu significativamente (p < 0,05) o aumento da expressão de ADAM -17 e a ativação do EGFR, induzidas por irradiação. Além disso, a terapia de associação diminui significativamente a formação de colônias das celulas A431 (91 ± 0,4 %), mesmo com cerca de metade da dose cumulativa. Os efeitos dos bloqueadores de integrina 4B4 e cRGD sobre a migração de células do melanoma humano da linhagem MV3 foram investigados, em cultivo celular 3D, mostrando que além de alterar a morfologia celular, o bloqueio das subunidades de integrina β1 e αvβ3 reduziram o índice de alongamento celular (3.8 ± 0.6 AU) quando comparado com o controle não tratado (8.5 ± 1.7 AU, p<0,001), bem como a velocidade média de migração 0.1 ± 0.06μm/minuto comparado ao controle não tratado 0.5 ± 0.1μm/minuto (p<0,001). Juntos, estes resultados contribuem para o desenvolvimento de nova estratégia de radioterapia para o tumor da cabeça e pescoço, com a combinação da terapia gênica e radiação ionizante, permitindo reduzir a exposição celular aos raios-X. / Radiotherapy is one important modality to treat Head and Neck cancer, however treatment failure has been observed and recurrence disease is common. New approaches to improve beneficial radiotherapy effects have been developed and gene therapy arises as an important tool to achieve this aim. Although in vitro models are useful to understand radiation effects at cellular levels one model more close to clinical irradiation schedule that allows reproduce daily irradiation is needed. Calcium signals in the nucleus have been demonstrated to play a crucial role in mammalian cells regulating the expression of genes involved in cell proliferation, and it also was demonstrated that the buffering of nuclear Ca2+ impairs the growth of cancer cells in vitro as well as in vivo. The aim of this study was to develop an in vitro protocol that simulated head and neck radiotherapy according to clinical parameters and investigate the role of nuclear Ca2+ buffering to enhance the antitumor effect of X-rays on Human Squamous Cell Carcinoma. For these purposes A431 cell line was submitted to 10Gy cumulative X-rays therapy alone (XRCd10Gy) or in association with nuclear Ca2+ buffering protocol (Ca2+n). Cell cycle analysis, proliferation assay, quantification of nuclear/mitochondrial DNA lesions, ADAM- 17, EGFR expression and survival fraction were investigated. Our model provided uniform irradiations to monolayer cells, minimizing uncertainties since independent of the flasks position inside irradiation field, all flasks received 100±2% of the total calculated dose. We found that XRCd10Gy induced only 4.3±0.3% of cell death (SubG1), indicating radioresistance. Upon Ca2+n buffering, A431 cell proliferation decreased significantly (p<0.001) as compared to control. Cell cycle analysis showed that association of Ca2+n buffering with XRCd10Gy increased the percentage of A431 cells at G2/M (35.7±2.5%) with no apparent nuclear/mitochondrial DNA damages. Nonetheless, Ca2+ n buffering significantly (p<0.05) prevented the increase in ADAM-17 expression and EGFR activation induced by irradiation. Furthermore, the association therapy significantly decreases the A431colony formation (91±0.4%), even using approximately half of the cumulative dose. The effects of Integrins blockage on human melanoma cell MV3 were investigated using 3D cell culture. There were phenotype alterations after blockage of β1 e αvβ3 integrins subunits using 4B4 and cRGD even reduction of elongation index (3.8 ± 0.6 AU) compared to untreated cells (8.5 ± 1.7 AU, p<0.001) as well as migration average speed was decreased 0.1 ± 0.06μm/minute after integrins blockage compared to untreated cells 0.5 ± 0.1μm/minute (p<0.001).Together, these findings contribute to the development of novel radiotherapy strategy to head and neck tumor, combining gene therapy with ionizing radiation, allowing reducing X-rays irradiation exposure