Submitted by Lucas Benites Doretto (lucasbdoretto@gmail.com) on 2019-02-01T13:11:58Z No. of bitstreams: 1 Doretto_2018.pdf: 4650233 bytes, checksum: 9bea19edf8684552c0f36f3b98fe9df8 (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2019-02-01T18:19:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 doretto_lb_me_bot.pdf: 4650233 bytes, checksum: 9bea19edf8684552c0f36f3b98fe9df8 (MD5) / Made available in DSpace on 2019-02-01T18:19:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 doretto_lb_me_bot.pdf: 4650233 bytes, checksum: 9bea19edf8684552c0f36f3b98fe9df8 (MD5) Previous issue date: 2018-12-20 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As células tronco são classificadas em dois grandes grupos de acordo com sua origem e capacidade de diferenciação. Células tronco embrionárias (CTE) são originadas do zigoto, e podem ser classificadas como totipotentes, isto é, capazes de originar um indivíduo inteiro, ou pluripotentes, quando originam os três folhetos embrionários (ecto, meso e endoderme). As células tronco adultas (CTA) são as células tronco encontradas nos tecidos fetais e adultos; classificadas como uni, oligo ou multipotentes dependendo da variedade de tecidos originados a partir delas. Marcadores de células tronco, como antígenos de superfície específicos, fatores de trancrição como OCT4 e NANOG são expressos em CTE e algumas CTA, mas são rapidamente reprimidos à medida que as células se diferenciam. O presente trabalho tem como objetivo identificar marcadores de células tronco e com isso, os efeitos do hormônio endócrino Fsh e do fator parácrino GDNF na atividade proliferativa e gênica dessas populações de células e também de células de Sertoli. Foi observado que os marcadores Pou5f3 e Gfra1a são principalmente expressos em espermatogônias tronco indiferenciadas e que sua expressão reduz significativamente sob efeito do recombinante zebrafish Fsh. Por outro lado, genes como o igf3, nanos3 e nanog tiveram sua expressão aumentada significativamente. O recombinante humano GDNF não altera significativamente a expressão desses genes, porém estimula a proliferação de espermatogônias tipo Aund e Adiff e células de Sertoli associadas. Logo, conclui-se que o rzfFsh atua de maneira endócrina na diferenciação de espermatogônias tronco Pou5f3+ e Gfra1a+ via células de Sertoli, visto que seu receptor é principalmente expresso em cistos indiferenciados. O rhGDNF, que por sua vez é expresso em células germinativas, estimula a proliferação de Aund e Adiff e células de Sertoli associadas através de seu receptor Gfra1a, expresso em ambas populações. / 2016/12101-4

Orientador: Rafael Henrique Nóbrega / Resumo: As células tronco são classificadas em dois grandes grupos de acordo com sua origem e capacidade de diferenciação. Células tronco embrionárias (CTE) são originadas do zigoto, e podem ser classificadas como totipotentes, isto é, capazes de originar um indivíduo inteiro, ou pluripotentes, quando originam os três folhetos embrionários (ecto, meso e endoderme). As células tronco adultas (CTA) são as células tronco encontradas nos tecidos fetais e adultos; classificadas como uni, oligo ou multipotentes dependendo da variedade de tecidos originados a partir delas. Marcadores de células tronco, como antígenos de superfície específicos, fatores de trancrição como OCT4 e NANOG são expressos em CTE e algumas CTA, mas são rapidamente reprimidos à medida que as células se diferenciam. O presente trabalho tem como objetivo identificar marcadores de células tronco e com isso, os efeitos do hormônio endócrino Fsh e do fator parácrino GDNF na atividade proliferativa e gênica dessas populações de células e também de células de Sertoli. Foi observado que os marcadores Pou5f3 e Gfra1a são principalmente expressos em espermatogônias tronco indiferenciadas e que sua expressão reduz significativamente sob efeito do recombinante zebrafish Fsh. Por outro lado, genes como o igf3, nanos3 e nanog tiveram sua expressão aumentada significativamente. O recombinante humano GDNF não altera significativamente a expressão desses genes, porém estimula a proliferação de espermatogônias tipo Aund e Adiff e célul... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

As lesões medulares acometem anualmente milhares de pessoas e animais em todo o mundo, causando diversos prejuízos econômicos e psicológicos. As principais causas das lesões medulares são traumas automobilísticos e doenças do disco intervertebral. Muito embora a medicina esteja bastante avançada no campo da neurocirurgia, a cura para esse tipo de lesão ainda esta longe de ser obtida. O avanço das pesquisas no campo da terapia celular em lesões medulares surge como uma esperança para os pacientes crônicos. Neste trabalho buscamos avaliar a reposta do tratamento com células-tronco de medula óssea fetal canina em cães com lesão medular crônica toracolombar. Nosso trabalho se baseia em parâmetros clínicos, comportamentais, de imagem e fisioterápicos. Antes de adentrar no experimento, todos os cães foram submetidos a vários exames pré-operatórios (hemograma, exames bioquímicos, eletrocardiograma) para então serem encaminhados para o exame de ressonância nuclear magnética visando um diagnostico mais preciso da lesão. Após esse exame, os cães foram avaliados por fisioterapeutas veterinários que não pertenciam ao nosso grupo de pesquisa para se estabelecer uma pontuação no teste comportamental de Olby. Os animais também tiveram alguns outros reflexos testados (dor profunda, reflexo de panículo). Após a primeira avaliação, os animais foram submetidos à procedimento cirúrgico de descompressão da medula espinhal e aplicação de células-tronco da medula óssea fetal canina. Durante o procedimento foram injetados 1x106 células diretamente em 3 pontos distintos da medula espinhal. Após o procedimento os cães foram encaminhados para a fisioterapia, e por 3 meses, foram submetidos a diversos exercícios de reabilitação com o intuito de potencializar um possível efeito benéfico da terapia celular. Durante a fisioterapia, os animais foram filmados com o intuito de acompanhar a sua evolução, e após o termino da fisioterapia foram novamente avaliados pelos fisioterapeutas. Ao final do experimento 7 animais foram operados e os resultados obtidos demonstraram um aumento do reflexo de marcha em 6 deles. O único animal que não apresentou essa melhora da marcha foi aquele acometido por outra patologia associada à compressão medular. Esses resultados nos levam a sugerir uma ação benéfica da terapia celular em cães portadores de lesão medular crônica. Por outro lado sugere continuar recrutando animais com o objetivo de aprimorar as técnicas utilizadas, para conseguir resultados cada vez melhores. / Spinal cord injuries annually involve thousands of people and animals worldwide, causing economic and psychological damages. The main causes of spinal cord injuries are vehicular traumas and intervertebral disc diseases. Although medicine is very advanced in neurosurgery field, the cure for this type of injury is still far from being achieved. Research progresses in cell therapy for spinal cord injuries appear to be a hope for chronic patients. In this article we aimed to evaluate clinical responses to the treatment using canine fetal bone marrow stem cells in dogs with thoracolumbar chronic spinal cord injury. Our study was based on the evaluation of clinical signs, animal behavior, imaging and physiotherapy aspects. Before clinical-surgery trial, all dogs underwent to preoperative tests as hemogram, blood chemistry, electrocardiogram and to nuclear magnetic resonance exam, in order to stablish more accurate diagnosis of the injury. Following clinical exams, Olby score was determined by evaluating animal behavior. Olby tests were performed by external scientific research group, composed by veterinary phisiotherapists, in order to guarantee blind evaluation. Animals were also tested to deep pain and panniculus reflexes. s, After being evaluated, animals underwent surgical spinal cord decompression and to a 1x106 stem cells injection in three different sites of the spinal cord. After the procedure, dogs were referred to physiotherapy for three months, undergoing to a variety of rehabilitation exercises in order to improve cell therapy hypothetical benefic effect. During therapy, animals were filmed in order to monitor their evolution, and after the end of physiotherapy they were re-evaluated by physiotherapists. At the end of the experiment, 7 animals were operated and had resulted in an increase of reflex motion in 6 of them. The only animal that showed no such improvement was the one whos had other pathology associated with the spinal cord compression, these results lead us to believe in a beneficial action of cell therapy in dogs with chronic spinal cord injury and suggests continue recruiting animas with the aim of improving the techniques used to achieve better results.

O meduloblastoma é o tumor maligno do sistema nervoso central mais frequente na infância e adolescência. A expressão de genes tipicamente expressos em células-tronco está correlacionada com pior prognóstico em pacientes com meduloblastoma e a expressão de POU5F1 se mostrou capaz de distinguir pacientes com desfecho clínico desfavorável e pior sobrevida. Apesar do seu valor prognóstico, não há evidências diretas da contribuição de OCT4 para a aquisição de fenótipos mais agressivos em meduloblastoma. Nesse contexto, o presente trabalho investigou o papel da isoforma OCT4A em características pró-tumorigênicas de meduloblastoma in vitro e in vivo, e também avaliou as alterações moleculares que podem ser responsáveis pela aquisição de fenótipo mais agressivo em células de meduloblastoma humano. Para tanto, foi realizada a superexpressão de OCT4A mediada por retrovírus em três linhagens celulares de meduloblastoma (Daoy, D283Med e USP-13-Med). As células de meduloblastoma com superexpressão de OCT4A exibiram maior proliferação e alterações no ciclo celular. Foram observados também aumentos na atividade clonogênica, geração de esferas tumorais e desenvolvimento tumoral em modelo subcutâneo, sendo esses efeitos dependentes dos níveis de OCT4A. A avaliação da mobilidade celular in vitro demonstrou diminuição na adesão celular e aumento da invasão celular de esferoide 3D. Em modelo ortotópico de meduloblastoma, as células com superexpressão de OCT4A geraram tumores mais desenvolvidos, com fenótipos mais agressivos, infiltrativos e metastáticos. A superexpressão de OCT4A foi associada a maior instabilidade genômica, entretanto, as aberrações em números de cópias variaram em frequência e tipo de alteração dependendo da linhagem celular, e sendo pouco associada com os genes diferencialmente expressos. De forma interessante, uma relevante expressão diferencial de RNAs não-codificadores de proteínas foi observada em células de meduloblastoma com superexpressão de OCT4A, incluindo os recém descobertos e pouco caracterizados RNAs não codificadores longos, além de múltiplos RNAs pequenos nucleolares. Assim, os resultados aqui apresentados fundamentam a relevância de fatores envolvidos em pluripotência para o agravamento de traços associados com desfecho clínico desfavorável em meduloblastoma e destacam o valor prognóstico e terapêutico de OCT4A neste tumor pediátrico do sistema nervoso central / Medulloblastoma is the most common malignant brain tumor in infants. The expression of typical pluripotency genes is correlated with poor prognosis in medulloblastoma and POU5F1 expression was shown capable of discriminating patients with poor survival outcome. Despite this prognostic value, direct evidences of OCT4 contribution to more aggressive traits in medulloblastoma are missing. In this context, we investigated the role of OCT4A isoform on pro-tumorigenic features of medulloblastoma in vitro and in vivo and evaluated molecular alterations that could be responsible for acquisition of a more aggressive phenotype in medulloblastoma cells. Retroviral-mediated overexpression of OCT4A were performed in three medulloblastoma cell lines (Daoy, D283Med and USP-13-Med). Medulloblastoma cells overexpressing OCT4A displayed enhanced cell proliferation and cell cycle alterations. Increased clonogenic activity, tumorsphere generation capability and subcutaneous tumor development were also observed, and these effects were OCT4A expression level-dependent. Evaluation of cell mobility in vitro showed loss of cell adhesion and greater 3D-spheroid invasion. In an orthotopic model of medulloblastoma, OCT4A overexpressing cells generated more developed, aggressive, infiltrative and metastatic tumors. OCT4A overexpression was associated with chromosomal instability but copy number aberrations varied in frequency and type according to the cell line, with little association with differently expressed genes. Interestingly, marked differential expression of non-coding RNAs, including newly discovered, still poorly characterized, long non-coding RNAs and multiple small nucleolar RNAs were observed in medulloblastoma cells with OCT4A overexpression. Altogether, our findings support the relevance of pluripotency-related factors in the aggravation of medulloblastoma traits classically associated with poor clinical outcome, and underscore the prognostic and therapeutic value of OCT4A in this challenging type of pediatric brain cancer

O saco vitelino é uma das membranas extra-embrionárias que desempenha um papel importante para a sobrevivência inicial do embrião, atua como fonte de nutrição durante o período em que a placenta verdadeira ainda não está completamente formada. É uma provável fonte de células tronco, o qual abriga as primeiras células do sangue durante o desenvolvimento em mamíferos, os eritrócitos, os quais expressam fatores de transcrição que especificam estas células a seu destino hematopoiético. O objetivo deste trabalho foi caracterizar as células tronco hematopoéticas provenientes do saco vitelino de embriões bovinos, em diferentes fases gestacionais, sendo estes coletados em abatedouro local. Para descrição da análise macroscópica e cultivo celular das células do saco vitelino, os embriões bovinos foram divididos em grupos de idade gestacional: Grupo I (25 a 29 dias), Grupo II (30 a 34 dias), Grupo III (35 a 39 dias), Grupo IV (40 a 44 dias) e Grupo V (45 a 50 dias) em que permaneceram mais tempo em cultura e apresentaram a formação de aglomerados celulares, diferente dos grupos IV e V (40 a 45 dias) em que permaneceram poucos dias em cultura e não apresentaram aglomerados celulares. Esta divergência relaciona-se à idade gestacional (45 a 50 dias), período em que se inicia a regressão do saco vitelino. Em citometria de fluxo os grupos I, II e III (25 a 39 dias) obtiveram características semelhantes, alta expressão de marcadores hematopoéticos (CD34, CD90 e CD117). Para os grupos IV e V (40 a 50 dias) observa-se um declínio da expressão de CD34 e CD117 (marcadores hematopoéticos) e no grupo V houve um acréscimo da expressão de CD45 (marcador para leucócito) confirmando que estas células não estão mantendo-se indiferenciadas As células demonstraram ser resistentes a criopreservação, capazes de formar colônias em matriz de Metilcelulose, mostraram a formação de colônias após 14 dias em cultivo e a morfologia para células sanguíneas (linfócitos e monócitos) foi confirmada na citologia celular. Na expressão gênica obteve-se baixa expressão do gene GATA3, níveis diferentes de expressão entre os grupos para o marcador RUNX1 e ANXA5. Dessa forma, nossos achados mais significativos comprovaram o isolamento de células hematopoéticas a partir do saco vitelino de embriões bovinos, sugerindo que este é uma fonte laboriosa, porém viável e eficaz para a obtenção de células tronco para futuras aplicações na terapia celular e gênica. / The yolk sac is one of the extra-embryonic membranes which plays an important role in early embryonic survival and serves as source of nutrition during the period where in the placenta is not completely true formed. The yolk sac is a likely source of stem cells, which have first blood cells during development in mammals, the red blood cells, which express transcription factors that specify these hematopoietic cells to their destination. This study aimed to identify and characterize hematopoietic stem cells from the yolk sac of bovine embryos at different stages of pregnancy, which are collected at a local slaughterhouse. For a description of the macroscopic and cellular culture of yolk sac cells, are as follows bovine embryos were divided into groups of gestational age: Group I (25 to 29 days), Group II (30 to 34 days), Group III (35 to 39 days ), Group IV (40 to 44 days) and Group V (45 to 50 days) which stayed longer in culture and showed the formation of cell clusters, different from groups IV and V (40-45 days) in few that remained days in culture and showed no cell clumps. This divergence is related to gestational age (45 to 50 days), during which begins regression of the yolk sac. In flow cytometry groups I, II and III (25 to 39 days) had similar characteristics, high expression of hematopoietic markers (CD34, CD90 and CD117). For the groups IV and V (40 to 50 days) it is observed a decrease in expression of CD117 and CD34 (hematopoietic markers) and in group V were increased expression of CD45 (leukocyte marker), confirming that these cells are not keeping Undifferentiated cells are shown to be resistant to cryopreservation, capable of forming colonies in methylcellulose matrix showed the formation of colonies after 14 days in culture morphology and to blood cells (lymphocytes and monocytes) was confirmed by cytology cell. In gene expression was low GATA3 gene expression, different levels of expression between the groups for the marker and RUNX1 ANXA5. Our most significant findings confirmed the isolation and identification of hematopoietic cells from the bovine embryo yolk sac, therefore, it is feasible and an effective way of obtaining stem cells for future applications in cell therapy and gene.

Orientador: Marca Antonio Alvarenga / Resumo: O presente estudo propõe avaliar a segurança da aplicação intratesticular de células tronco mesenquimais alogênicas obtidas da medula óssea e verificar o efeito DO tratamento com as células tronco mesenquimais (CTMs) em garanhões submetidos a degeneração testicular. Para o primeiro estudo, foram usados 24 garanhões sadios, nos quais os testiculos foram mensurados, termografia, ultrassonografia doppler, cinética espermática e dosagem hormonal. Os grupos foram separados aleatoriamente em grupo controle (GC) e grupo células tronco mesenquimais (CTMs). No GC foram realizadas aplicações intratesticulares com PBS (solução tampão) e no CTMs solução contendo células. Os animais foram avaliados após a aplicação e aos 15 dias foram orquiectomizados. Os fragmentos testiculares foram destinados para histologia. Os exames clínicos não mostraram declínio na condição geral dos animais após a aplicação e não houve diferença significativa nas variáveis volume, temperatura superficial e ultrassonografia testicular, cinética espermática, analise sérica hormonal e histologia em ambos os grupos. Desta forma, conclui-se que a aplicação intratesticular de CTMs alogênicas da medula óssea é um processo seguro, pois não provocou alterações locais. Para o segundo estudo, um grupo de 10 garanhões foram divididos em dois grupos: grupo controle (CT) e grupo tratado (TT). Os animais foram submetidos ao estresse térmico escrotal, acoplando uma bolsa termica nos testiculos, durante 3 horas por 3 dias consecu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: Elenice Deffune / Resumo: Diante do crescente uso de células-tronco em medicina regenerativa aliada a importância de diagnóstico rápido, os imunossensores surgem como ferramentas que propiciam rapidez, seletividade e sensibilidade. Foi investigada a construção de um imunossensor para identificação de células-tronco mesenquimais de coelho frente à inexistência no mercado, de marcadores específicos para a espécie. Com o objetivo de identificar a célula-tronco mesenquimal (CTM) em amostras biológicas, foi proposto a construção de filmes pela técnica layer-by-layer (LbL) com solução de quitosana e anticorpo monoclonal de especificidade anti-CD90 produzido home made (HM) para aplicação em imunossensores eletroquímicos. Inicialmente foi caracterizado o anticorpo monoclonal produzido por técnicas imunoquímicas. A classe do anticorpo produzido é IgG1. O crescimento dos filmes foi confirmado por voltametria cíclica (VC) pela área dos voltamogramas. A distorção dos voltamogramas foi observada com maior adsorção em 4 bicamadas, considerado como cobertura completa do eletrodo. Foi padronizado e produzido o biofilme de 4 bicamadas para fixação dos anticorpos monoclonais murinos anti-CD90 HM com solução de quitosana 0,2%. A análise dos resultados obtidos com imunossensor comparando-se com a citometria de fluxo identifica a elevada sensibilidade do mesmo para a confirmação da presença de CTM em amostras biológicas, havendo necessidade de mais desenvolvimento para a quantificação das células. A partir de uma concent... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

O saco vitelino é uma das membranas extra-embrionárias que desempenha um papel importante para a sobrevivência inicial do embrião, atua como fonte de nutrição durante o período em que a placenta verdadeira ainda não está completamente formada. É uma provável fonte de células tronco, o qual abriga as primeiras células do sangue durante o desenvolvimento em mamíferos, os eritrócitos, os quais expressam fatores de transcrição que especificam estas células a seu destino hematopoiético. O objetivo deste trabalho foi caracterizar as células tronco hematopoéticas provenientes do saco vitelino de embriões bovinos, em diferentes fases gestacionais, sendo estes coletados em abatedouro local. Para descrição da análise macroscópica e cultivo celular das células do saco vitelino, os embriões bovinos foram divididos em grupos de idade gestacional: Grupo I (25 a 29 dias), Grupo II (30 a 34 dias), Grupo III (35 a 39 dias), Grupo IV (40 a 44 dias) e Grupo V (45 a 50 dias) em que permaneceram mais tempo em cultura e apresentaram a formação de aglomerados celulares, diferente dos grupos IV e V (40 a 45 dias) em que permaneceram poucos dias em cultura e não apresentaram aglomerados celulares. Esta divergência relaciona-se à idade gestacional (45 a 50 dias), período em que se inicia a regressão do saco vitelino. Em citometria de fluxo os grupos I, II e III (25 a 39 dias) obtiveram características semelhantes, alta expressão de marcadores hematopoéticos (CD34, CD90 e CD117). Para os grupos IV e V (40 a 50 dias) observa-se um declínio da expressão de CD34 e CD117 (marcadores hematopoéticos) e no grupo V houve um acréscimo da expressão de CD45 (marcador para leucócito) confirmando que estas células não estão mantendo-se indiferenciadas As células demonstraram ser resistentes a criopreservação, capazes de formar colônias em matriz de Metilcelulose, mostraram a formação de colônias após 14 dias em cultivo e a morfologia para células sanguíneas (linfócitos e monócitos) foi confirmada na citologia celular. Na expressão gênica obteve-se baixa expressão do gene GATA3, níveis diferentes de expressão entre os grupos para o marcador RUNX1 e ANXA5. Dessa forma, nossos achados mais significativos comprovaram o isolamento de células hematopoéticas a partir do saco vitelino de embriões bovinos, sugerindo que este é uma fonte laboriosa, porém viável e eficaz para a obtenção de células tronco para futuras aplicações na terapia celular e gênica. / The yolk sac is one of the extra-embryonic membranes which plays an important role in early embryonic survival and serves as source of nutrition during the period where in the placenta is not completely true formed. The yolk sac is a likely source of stem cells, which have first blood cells during development in mammals, the red blood cells, which express transcription factors that specify these hematopoietic cells to their destination. This study aimed to identify and characterize hematopoietic stem cells from the yolk sac of bovine embryos at different stages of pregnancy, which are collected at a local slaughterhouse. For a description of the macroscopic and cellular culture of yolk sac cells, are as follows bovine embryos were divided into groups of gestational age: Group I (25 to 29 days), Group II (30 to 34 days), Group III (35 to 39 days ), Group IV (40 to 44 days) and Group V (45 to 50 days) which stayed longer in culture and showed the formation of cell clusters, different from groups IV and V (40-45 days) in few that remained days in culture and showed no cell clumps. This divergence is related to gestational age (45 to 50 days), during which begins regression of the yolk sac. In flow cytometry groups I, II and III (25 to 39 days) had similar characteristics, high expression of hematopoietic markers (CD34, CD90 and CD117). For the groups IV and V (40 to 50 days) it is observed a decrease in expression of CD117 and CD34 (hematopoietic markers) and in group V were increased expression of CD45 (leukocyte marker), confirming that these cells are not keeping Undifferentiated cells are shown to be resistant to cryopreservation, capable of forming colonies in methylcellulose matrix showed the formation of colonies after 14 days in culture morphology and to blood cells (lymphocytes and monocytes) was confirmed by cytology cell. In gene expression was low GATA3 gene expression, different levels of expression between the groups for the marker and RUNX1 ANXA5. Our most significant findings confirmed the isolation and identification of hematopoietic cells from the bovine embryo yolk sac, therefore, it is feasible and an effective way of obtaining stem cells for future applications in cell therapy and gene.

As lesões medulares acometem anualmente milhares de pessoas e animais em todo o mundo, causando diversos prejuízos econômicos e psicológicos. As principais causas das lesões medulares são traumas automobilísticos e doenças do disco intervertebral. Muito embora a medicina esteja bastante avançada no campo da neurocirurgia, a cura para esse tipo de lesão ainda esta longe de ser obtida. O avanço das pesquisas no campo da terapia celular em lesões medulares surge como uma esperança para os pacientes crônicos. Neste trabalho buscamos avaliar a reposta do tratamento com células-tronco de medula óssea fetal canina em cães com lesão medular crônica toracolombar. Nosso trabalho se baseia em parâmetros clínicos, comportamentais, de imagem e fisioterápicos. Antes de adentrar no experimento, todos os cães foram submetidos a vários exames pré-operatórios (hemograma, exames bioquímicos, eletrocardiograma) para então serem encaminhados para o exame de ressonância nuclear magnética visando um diagnostico mais preciso da lesão. Após esse exame, os cães foram avaliados por fisioterapeutas veterinários que não pertenciam ao nosso grupo de pesquisa para se estabelecer uma pontuação no teste comportamental de Olby. Os animais também tiveram alguns outros reflexos testados (dor profunda, reflexo de panículo). Após a primeira avaliação, os animais foram submetidos à procedimento cirúrgico de descompressão da medula espinhal e aplicação de células-tronco da medula óssea fetal canina. Durante o procedimento foram injetados 1x106 células diretamente em 3 pontos distintos da medula espinhal. Após o procedimento os cães foram encaminhados para a fisioterapia, e por 3 meses, foram submetidos a diversos exercícios de reabilitação com o intuito de potencializar um possível efeito benéfico da terapia celular. Durante a fisioterapia, os animais foram filmados com o intuito de acompanhar a sua evolução, e após o termino da fisioterapia foram novamente avaliados pelos fisioterapeutas. Ao final do experimento 7 animais foram operados e os resultados obtidos demonstraram um aumento do reflexo de marcha em 6 deles. O único animal que não apresentou essa melhora da marcha foi aquele acometido por outra patologia associada à compressão medular. Esses resultados nos levam a sugerir uma ação benéfica da terapia celular em cães portadores de lesão medular crônica. Por outro lado sugere continuar recrutando animais com o objetivo de aprimorar as técnicas utilizadas, para conseguir resultados cada vez melhores. / Spinal cord injuries annually involve thousands of people and animals worldwide, causing economic and psychological damages. The main causes of spinal cord injuries are vehicular traumas and intervertebral disc diseases. Although medicine is very advanced in neurosurgery field, the cure for this type of injury is still far from being achieved. Research progresses in cell therapy for spinal cord injuries appear to be a hope for chronic patients. In this article we aimed to evaluate clinical responses to the treatment using canine fetal bone marrow stem cells in dogs with thoracolumbar chronic spinal cord injury. Our study was based on the evaluation of clinical signs, animal behavior, imaging and physiotherapy aspects. Before clinical-surgery trial, all dogs underwent to preoperative tests as hemogram, blood chemistry, electrocardiogram and to nuclear magnetic resonance exam, in order to stablish more accurate diagnosis of the injury. Following clinical exams, Olby score was determined by evaluating animal behavior. Olby tests were performed by external scientific research group, composed by veterinary phisiotherapists, in order to guarantee blind evaluation. Animals were also tested to deep pain and panniculus reflexes. s, After being evaluated, animals underwent surgical spinal cord decompression and to a 1x106 stem cells injection in three different sites of the spinal cord. After the procedure, dogs were referred to physiotherapy for three months, undergoing to a variety of rehabilitation exercises in order to improve cell therapy hypothetical benefic effect. During therapy, animals were filmed in order to monitor their evolution, and after the end of physiotherapy they were re-evaluated by physiotherapists. At the end of the experiment, 7 animals were operated and had resulted in an increase of reflex motion in 6 of them. The only animal that showed no such improvement was the one whos had other pathology associated with the spinal cord compression, these results lead us to believe in a beneficial action of cell therapy in dogs with chronic spinal cord injury and suggests continue recruiting animas with the aim of improving the techniques used to achieve better results.

O meduloblastoma é o tumor maligno do sistema nervoso central mais frequente na infância e adolescência. A expressão de genes tipicamente expressos em células-tronco está correlacionada com pior prognóstico em pacientes com meduloblastoma e a expressão de POU5F1 se mostrou capaz de distinguir pacientes com desfecho clínico desfavorável e pior sobrevida. Apesar do seu valor prognóstico, não há evidências diretas da contribuição de OCT4 para a aquisição de fenótipos mais agressivos em meduloblastoma. Nesse contexto, o presente trabalho investigou o papel da isoforma OCT4A em características pró-tumorigênicas de meduloblastoma in vitro e in vivo, e também avaliou as alterações moleculares que podem ser responsáveis pela aquisição de fenótipo mais agressivo em células de meduloblastoma humano. Para tanto, foi realizada a superexpressão de OCT4A mediada por retrovírus em três linhagens celulares de meduloblastoma (Daoy, D283Med e USP-13-Med). As células de meduloblastoma com superexpressão de OCT4A exibiram maior proliferação e alterações no ciclo celular. Foram observados também aumentos na atividade clonogênica, geração de esferas tumorais e desenvolvimento tumoral em modelo subcutâneo, sendo esses efeitos dependentes dos níveis de OCT4A. A avaliação da mobilidade celular in vitro demonstrou diminuição na adesão celular e aumento da invasão celular de esferoide 3D. Em modelo ortotópico de meduloblastoma, as células com superexpressão de OCT4A geraram tumores mais desenvolvidos, com fenótipos mais agressivos, infiltrativos e metastáticos. A superexpressão de OCT4A foi associada a maior instabilidade genômica, entretanto, as aberrações em números de cópias variaram em frequência e tipo de alteração dependendo da linhagem celular, e sendo pouco associada com os genes diferencialmente expressos. De forma interessante, uma relevante expressão diferencial de RNAs não-codificadores de proteínas foi observada em células de meduloblastoma com superexpressão de OCT4A, incluindo os recém descobertos e pouco caracterizados RNAs não codificadores longos, além de múltiplos RNAs pequenos nucleolares. Assim, os resultados aqui apresentados fundamentam a relevância de fatores envolvidos em pluripotência para o agravamento de traços associados com desfecho clínico desfavorável em meduloblastoma e destacam o valor prognóstico e terapêutico de OCT4A neste tumor pediátrico do sistema nervoso central / Medulloblastoma is the most common malignant brain tumor in infants. The expression of typical pluripotency genes is correlated with poor prognosis in medulloblastoma and POU5F1 expression was shown capable of discriminating patients with poor survival outcome. Despite this prognostic value, direct evidences of OCT4 contribution to more aggressive traits in medulloblastoma are missing. In this context, we investigated the role of OCT4A isoform on pro-tumorigenic features of medulloblastoma in vitro and in vivo and evaluated molecular alterations that could be responsible for acquisition of a more aggressive phenotype in medulloblastoma cells. Retroviral-mediated overexpression of OCT4A were performed in three medulloblastoma cell lines (Daoy, D283Med and USP-13-Med). Medulloblastoma cells overexpressing OCT4A displayed enhanced cell proliferation and cell cycle alterations. Increased clonogenic activity, tumorsphere generation capability and subcutaneous tumor development were also observed, and these effects were OCT4A expression level-dependent. Evaluation of cell mobility in vitro showed loss of cell adhesion and greater 3D-spheroid invasion. In an orthotopic model of medulloblastoma, OCT4A overexpressing cells generated more developed, aggressive, infiltrative and metastatic tumors. OCT4A overexpression was associated with chromosomal instability but copy number aberrations varied in frequency and type according to the cell line, with little association with differently expressed genes. Interestingly, marked differential expression of non-coding RNAs, including newly discovered, still poorly characterized, long non-coding RNAs and multiple small nucleolar RNAs were observed in medulloblastoma cells with OCT4A overexpression. Altogether, our findings support the relevance of pluripotency-related factors in the aggravation of medulloblastoma traits classically associated with poor clinical outcome, and underscore the prognostic and therapeutic value of OCT4A in this challenging type of pediatric brain cancer