Submitted by Geyciane Santos (geyciane_thamires@hotmail.com) on 2015-06-10T13:30:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Nadja Pinto Garcia.pdf: 2876829 bytes, checksum: 836b1ac1a926c0202497b6aaef613039 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-11T19:15:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Nadja Pinto Garcia.pdf: 2876829 bytes, checksum: 836b1ac1a926c0202497b6aaef613039 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-11T19:20:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Nadja Pinto Garcia.pdf: 2876829 bytes, checksum: 836b1ac1a926c0202497b6aaef613039 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-11T19:20:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Nadja Pinto Garcia.pdf: 2876829 bytes, checksum: 836b1ac1a926c0202497b6aaef613039 (MD5) Previous issue date: 2011-11-24 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The mesenchymal stem cells (MSCs) have regenerative potential by its plasticity and ability to modulate the immune response with immunossupressive effects and secretion of a broadspectrum cytokines. The G-CSF is a potent cell growth factor and has the ability to mobilize SCs into peripheral blood. The aim of this study was to evaluated the influence of different doses of G-CSF on the kinetics at HSC and MSCs mobilization into peripheral blood and the G-CSF effect on the cytokine profile produced by these cells in vitro. We used six groups of 12 female Swiss mice, control group and five doses groups 1, 2, 3, 4 and 5 of G-CSF. The HSCs and MSCs mobilized were identified using cell markers performed by flow cytometry. The peripheral blood (PB) and bone marrow (BM) samples were used of each group to obtain the HSCs and MSCs, which were cultivated in vitro. Cytokines were measured in supernatants of PB and BM cultures by Cytometric Bead Array (CBA). The MSCs mobilized peak occurred with 4 doses of G-CSF in BM and 5 doses in PB. The HSC peaked occurred with 2 doses of G-CSF in BM and 4 doses in PB. There was a greater mobilization of MSCs than HSC, but that reason MSC/HSC was even greater in BM. The BM Cultures doses 3, 4 and 5 of G-CSF showed fibroblastoid adherent cells while in the PB cultures it was in cultures doses 2 and 3 doses of G-CSF. There was an increased production of IL-6, TNF-α in early cultivation of the SCs both BM and PB. The IFN-γ was increased in the initial phase, but peaked at the end of cultivation. The IL-2, IL-4, IL-17A and IL-10 cytokines had similar behavior reaching peak concentration in the late stage of cultivation. In the analysis of high frequency of cytokine producers for each dose of G-CSF in vivo, we observed same behavior cytokine in BM and PB cultures. Most of the cytokines produced in both BM and PB cultures of five doses showed significant differences about lower doses of G-CSF. This study suggested a possible influence of G-CSF to mobilize cells, as is known, but also in the production of several inflammatory and anti-inflammatory cytokines and possibly stimulate and modulate the differentiation of MSCs. / As células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam potencial regenerativo não somente pela sua plasticidade, mas também pela sua capacidade de modular a resposta imunológica com efeitos imunossupressores e secreção de um largo espectro citocinas. O G-CSF é um potente fator de crescimento celular e tem a capacidade de mobilizar as CTs para o sangue periférico permitindo fácil obtenção destas células. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência de diferentes doses de G-CSF na cinética de mobilização das CTHs e CTMs para o sangue periférico e no perfil de citocinas produzidas in vitro por essas células. Foram utilizados 6 grupos com 12 camundongos fêmeas Swiss, grupo controle e 5 grupos de doses 1, 2, 3, 4 e 5 de G-CSF. As CTHs e CTMs mobilizadas foram identificadas por meio de marcadores celulares específicos por citometria de fluxo. As amostras de CTHs e CTMs, de sangue periférico (SP) e medula óssea (MO) foram cultivadas in vitro e as citocinas foram dosadas nos sobrenadantes destas culturas pela técnica de Cytometric Bead Array (CBA). O pico de CTMs mobilizadas ocorreu com 4 doses na MO e com 5 doses de G-CSF no SP. As CTHs atingiram o pico com 2 doses de G-CSF na MO e com 4 doses no SP. Houve uma maior mobilização de CTMs do que CTHs, porém essa razão CTM/CTH ainda foi maior na MO. As culturas de MO das doses 3, 4 e 5 de G-CSF apresentaram células aderentes fibroblastóides, enquanto que foram observadas nas culturas de sangue de 2 e 3 doses de G-CSF. Houve uma maior produção das citocinas IL-6, TNF-α na fase inicial do cultivo das CTs, tanto MO quanto SP. O IFN-γ apresentou-se elevado na fase inicial, porém atingiu um pico no final do cultivo. As citocinas IL-2, IL-4, IL-17A e IL-10 tiveram um comportamento semelhante atingindo pico de concentração na fase tardia do cultivo. Na análise da frequência de altos produtores de citocinas para cada dose administrada de G-CSF in vivo, observou-se um comportamento semellhante das citocinas das culturas de MO e SP. A maioria das citocinas produzidas nas culturas de 5 doses tanto de MO quanto de SP apresentaram diferença significativa com relação a doses inferiores de G-CSF. Esse estudo sugeriu uma possível influência do G-CSF não somente na mobilização, como já é conhecido, mas também na produção de várias citocinas inflamatórias e anti-inflamatótrias, podendo possivelmente atuar no estímulo da diferenciação e modulação das CTMs.

Os tumores embrionários do Sistema Nervoso Central (SNC) são os mais comuns em crianças de zero a quatro anos e a principal causa de mortalidade infantil. O tratamento convencional desses tumores malignos resulta em diversas sequelas que afetam significativamente a qualidade de vida dos sobreviventes. Diferentes estudos têm demonstrado que a ativação de genes tipicamente expressos em células-tronco, como o fator de pluripotência OCT4A, confere características mais primitivas e agressivas às células tumorais, frequentemente associadas ao prognóstico clínico desfavorável. Fundamentado na hipótese da existência das células-tronco tumorais (CTT) e sua contribuição na progressão tumoral, o presente estudo pré-clínico teve como objetivo identificar novos biomarcadores moleculares em tumores embrionários agressivos do SNC e avaliar novas abordagens terapêuticas capazes de destruir as CTT. A análise de proteomica e sequenciamento de microRNAs (miRNAs) presentes em microvesículas (MVs) derivadas de quatro linhagens celulares de meduloblastoma (DAOY, CHLA-01-MED, D283-MED e USP13-MED) identificou 464 proteínas e 10 miRNAs comumente expressos nas células tumorais com superexpressão de OCT4A. O estudo global de interação dessas proteínas e miRNAs exclusivamente expressas nas MVs derivadas das células tumorais com maior agressivas revelaram alteração em vias de sinalização como ERK, PI3K/AKT/mTOR, EGF/EGFR, e principalmente vias envolvidas com a auto renovação de células-tronco embrionárias (CTE). Dentre os fatores encontrados expressos nas MVs derivadas de células com superexpressão de OCT4A, quatro proteínas (UBE2M, HNRNPCL2, HNRNPCL3, HNRNPCL4) e cinco miRNAs (miR-4449, miR-500b, miR-3648, miR-1291, miR-3607) não apresentam relatos de expressão em tecidos normais, plasma ou soro sanguíneo. O miR-367, importante para a manutenção do estado pluripotente em CTE, também apresentou aumento dos níveis de expressão nas MVs derivadas de linhagens celulares de tumores embrionários do SNC com superexpressão de OCT4A. A inibição do miR-367 diminuiu significativamente a proliferação e invasão celular, a atividade clonogênica e a capacidade de gerar neuroesferas em todas as linhagens celulares de tumores embrionários do SNC. Em modelo pré-clínico de camundongos Balb/C Nude submetido ao xenoenxerto de tumores embrionários com superexpressão de OCT4A, foi demostrado que injeções seriadas do miR-367 inhibitor diretamente no líquido cefaloraquidiano foram capazes de inibir a progressão tumoral e aumentar significativamente a sobrevida in vivo. Neste mesmo estudo, foi comprovado que o SUZ12, componente do complexo PRC2 envolvido com o silenciamento epigenético de fatores de pluripotência, incluindo o gene POU5F1 que codifica o OCT4A, é alvo direto do miR-367. Por fim, visto que o vírus ZIKA (ZIKV) infecta preferencialmente células progenitoras neurais (NPCs), enquanto neurônios não são susceptíveis a infecção, inibindo a proliferação das células alvo, como também induzindo a diferenciação prematura e morte por apoptose, o efeito oncolítico do ZIKV também foi avaliado em tumores embrionários do SNC cujas células tumorais apresentam propriedades de células-tronco. A ZIKV infectou seletivamente e causou morte celular nas células tumorais de origem neural, porém o mesmo não foi observado nas células oriundas de tumor humanos mais comuns como tumor próstata, colorretal e mama. Em ensaio de cultura 3D, o ZIKV foi capaz de destruir as esferas de tumores embrionários do SNC com mais eficiência quando comparadas com neuroesferas normais formadas a partir de NPCs. Em ensaio in vivo, uma única injeção intracerebroventricular contendo mil partículas virais do ZIKV brasileiro foi capaz de aumentar significativamente a sobrevida de camundongos com tumores embrionários de origem humana, diminuir o tamanho do tumor, os sítios metastáticos, e apresentar remissão completa do tumor em vários animais. Adicionalmente, células tumorais com fenótipo molecular similar às NPCs e com ativação anormal da via de sinalização Wnt apresentaram maior suscetibilidade aos efeitos oncolíticos do ZIKV. Portanto, ao realizar a modulação da via Wnt, foi observado uma alteração significativa na infecção e morte celular causada pelo ZIKV. Deste modo, podemos concluir que diversas proteínas e miRNAs foram encontradas presentes exclusivamente em MVs derivadas de células tumorais com superexpressão de OCT4A e poderiam ser utilizadas como biomarcadores de agressividade em meduloblastoma. Adicionalmente, os ensaios in vitro e in vivo evidenciaram o miR-367, envolvido na regulação da auto renovação de CTE, como oncomiR e possível alvo terapêutico no tratamento de tumores embrionários do SNC. Além disso, o ZIKV demostrou potente e seletivo efeito oncolítico nas células tumorais do SNC com caráter progenitor e apresentou níveis de infecção mais proeminente nas células com alta expressão basal de Wnt/β -catenina. Portanto, os resultados pré-clínicos encontrados no presente estudo evidenciam novos biomarcadores de células tumorais agressivas com perfil de células-tronco, que podem ser explorados em futuras pesquisas translacionais de refinamento do diagnóstico clínico, estratificação de pacientes, detecção precoce de recidiva tumoral, além de revelar novas abordagens terapêuticas direcionadas às CTTs, beneficiando os pacientes afetados com tumores embrionários do SNC cujas terapias convencionais não são efetivas / Embryonal tumors of central nervous system (CNS) are the most fatal pediatric tumors occurring in young children. Treatment of these aggressive CNS tumors may also result in serious long-term sequelae, affecting the patient\'s quality of life. Several studies have demonstrated that activation of genes encoding proteins typically expressed in stem cells, such as the pluripotency factor OCT4A, confers more primitive and aggressive features to tumor cells. These stem-like features in cancer cells are often associated with unfavorable clinical prognosis. The aim of this preclinical study was to identify new molecular markers of aggressive embryonal CNS tumor cells and evaluate new therapeutic approaches capable of killing these stem-like tumor cells of the CNS. The rationale of this study considered the existence of the so called cancer stem cells (CSC) and their contribution to tumor progression. Proteome analysis and miRNA sequencing of microvesicles (MVs) derived from four distinct medulloblastoma cell lines (DAOY, CHLA-01-MED, D283-MED, and USP13-MED) identified a common set of 464 proteins and 10 microRNAs associated with aggressive OCT4A-overexpressing tumor cells. The interactome mapping of these exclusive proteins and miRNAs revealed ERK, PI3K/AKT/mTOR, EGF/EGFR, and embryonic stem cell (ESC) self-renewal as the main oncogenic signaling pathways altered in these aggressive medulloblastoma cells. Of these MV cargos, four proteins (UBE2M, HNRNPCL2, HNRNPCL3, HNRNPCL4) and five miRNAs (miR-4449, miR-500b, miR-3648, miR-1291, miR-3607) have not been previously reported in MVs from normal tissues. The miR-367 was another new ESC-related miRNA found up-regulated in embryonal CNS tumor cells overexpressing OCT4A. Inhibition of miR-367 in these cells significantly reduced their proliferative and invasive behavior, clonogenic activity, and tumorsphere generation capability. Therapeutic targeting of miR-367 in vivo, through direct injections of a specific inhibitor in the cerebrospinal fluid (CSF) of Balb/C Nude mice bearing OCT4A-overexpressing tumor xenografts, inhibited tumor development and improved overall survival. miR-367 was also shown to target SUZ12, one of the core components of the PRC2 complex known to be involved in epigenetic silencing of pluripotency-related genes, including POU5F1 encoding OCT4A. Finally, considering that the Zika virus (ZIKV) prominently infects and kills neural stem and progenitor cells (NPCs), we also tested whether ZIKV would have the same effects in CNS embryonal tumors, given that these tumors are originated from NPC aberrations and are comprised by cells with neural stem cell-like features. When evaluating the oncolytic properties of Brazilian ZIKV strain against human breast, prostate, colorectal and embryonal CNS tumor cell lines, a selective infection of CNS tumor cells, followed by a massive tumor cell death, was verified. Notably, ZIKV was more efficient in destroying embryonal CNS tumorspheres than normal stem cell neurospheres. A single intracerebroventricular injection of ZIKV in BALB/c nude mice bearing orthotopic human embryonal CNS tumor xenografts resulted in significantly longer survival, decreased tumor burden, fewer metastasis and complete remission in some animals. Tumor cells closely resembling neural stem cells at the molecular level and with activated Wnt signaling were more susceptible to ZIKV oncolytic effects. Furthermore, modulation of Wnt signaling pathway significantly affected ZIKV-induced tumor cell death and viral shedding. In conclusion, several proteins and miRNA were identified exclusively in MVs from OCT4A-overexpressing tumor cells, which might serve as biomarkers of aggressive stem-like medulloblastoma cells. The miR-367 involved in ESC self-renewal displayed properties typical of oncomiRs as indicated by in vitro and in vivo assays, supporting its eligibility as a therapeutic target in embryonal CNS tumor cells. Also, ZIKV displayed potent and selective oncolytic effects toward human embryonal CNS tumor cells, at low infection rates. These effects were more prominent in tumors generated by neural stem-like cancer cells with high Wnt/β-catenin basal activity. Altogether, these preclinical findings open opportunities of future translational studies to evaluate new putative biomarkers of aggressive stem-like tumor cells in refining diagnosis, patient stratification, and early detection of relapsed disease, while also revealing novel therapeutic approaches targeting these stem-like tumor cells that could benefit patients affected by CNS tumors lacking effective treatment

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-21T13:39:52Z No. of bitstreams: 1 mariziatrevizani.pdf: 1220027 bytes, checksum: 70abc77309c910bd7507cd8ebeed0526 (MD5) / Rejected by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br), reason: on 2017-08-24T11:31:11Z (GMT) / Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-24T15:20:42Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-30T14:33:33Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2017-08-30T14:33:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2017-02-22 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A evolução das técnicas de cultura de células levaram à necessidade de eliminar componentes de origem animal, de modo a evitar a contaminação bacteriana, viral ou priônica. As células-tronco da polpa dentária são células-tronco multipotentes que apresentam alta plasticidade, sendo capazes de se diferenciar em linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica. O presente trabalho tem como objetivo testar a utilização de peptonas vegetais (ervilha, trigo e soja) nas concentrações de 0,5%; 1% e 5% como possíveis substitutos para 10% de soro bovino fetal (SFB) em cultura de CTs. A proliferação celular foi avaliada pelo método de MTT analisado em espectrofotómetro (VarioSkan). Realizou-se a diferenciação osteogênica e empregou-se a coloração Vermelho de Alizarina para testar o suporte de diferenciação. Medimos a concentração de deposição de cálcio ressuspendendo o conteúdo de Vermelho de Alizarina em solução alcoólica e analisando espectrofotometricamente. O ensaio de MTT e ensaios de diferenciação osteogênica permitiram concluir que a peptona de trigo a 1% foi a mais eficiente nas condições empregadas. A concentração de 5% de todas as peptonas utilizadas foi tóxica. Ao analisar os aminogramas das três peptonas, foi possível inferir que a maior eficiência da peptona de trigo pode estar relacionada à maior proporção de prolina e ácido glutâmico. / The evolution of cell culture techniques led to the necessity of eliminating components with animal origin, in order to prevent bacterial, viral or prionic contamination. Deciduous teeth dental pulp stem cells are multi potent stem cells which present high plasticity, being able to differentiate into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. The present work aims at testing the utilization of vegetal peptones (pea, wheat and soy) at the concentrations 0.5%; 1%, and 5% as possible substitutes for 10% Fetal Bovine Serum (FBS) in SCs culture. Cell proliferation was assayed by the MTT method analyzed on spectrophotometer (VarioSkan). We performed osteogenic differentiation and employed Alizarin Red staining in order to test the differentiation support. We measured the concentration of calcium deposition by ressuspending the alizarin red content in alcoholic solution and by analyzing spectrophotometrically. MTT and osteogenic differentiation essays allowed to conclude that wheat peptone at 1% was the most efficient in the conditions employed. The concentration of 5% of all the peptones utilized was toxic. Upon analyzing the aminograms of the three peptones, it was possible to infer that the higher efficiency of wheat peptone may relate to the greater proportion of proline and glutamic acid.

Precursores neurais originados na zona subventricular (ZSV) de algumas espécies animais possuem uma rota de migração neuronal destinada ao bulbo olfatório principal (BOP), onde os neuroblastos migrantes se diferenciam em interneurônios. Esta corrente migratória é mantida na idade adulta. A compreensão de como se organiza na idade fetal é essencial para a compreensão geral e estabelecimento de novas terapias celulares. O objetivo deste estudo é caracterizar a composição celular e organização morfológica da ZSV e da corrente rostral migratória (CRM) em encéfalos de fetos caninos. A ZSV, CRM e BOP foram obtidos de fetos caninos de aproximadamente 57 dias de idade gestacional. O tecido foi analisado através de coloração de Nissl, método de imunohistoquímica de dupla marcação com duplacortina (DCX), fator de transcrição SOX2, proteína glial fibrilar ácida (GFAP), calbindina (CALB), calretinina (CALR) e tirosina-hidroxilase (TH). Foram feitas a análise relativa da expressão da imunorreatividade e análise quantitativa de colocalização celular, além do método de microscopia eletrônica de transmissão. Os resultados mostram que a ZSV dorsal possui células imunorreativas (ir) para o DCX ao longo da parede ventricular, dispostas tangencialmente e fileiras de células SOX2-ir foram encontradas na mesma orientação. A imunorreatividade de GFAP foi mais forte na ZSV dorsal e as células possuem fibras dirigidas tangencialmente adjacentes ao ventrículo lateral e fibras orientadas radialmente em direção ao córtex. A CRM de feto de cão tem início na ZSV anterior e segue caudalmente ao redor da cabeça do núcleo caudado e desce na vertical até se curvar rostralmente em direção ao BOP onde termina na camada de células granulares (CCG). A CRM tem aparência homogênea e densa e possui células positivas para o DCX nas porções iniciais e para SOX2 e GFAP por toda a extensão. Não houve células positivas para CALB, CALR e TH em nenhuma região da ZSV e CRM. No BOP, os resultados mostraram que a camada glomerular (CG) possui células imunorreativas a CALR, TH, SOX2 e GFAP. Na camada plexiforme externa (CPE) houve células imunorreativas a CALB, CALR, SOX2 e GFAP e na CCG, houve células imunorreativas a CALR, SOX2 e GFAP. Na análise de colocalização, foram encontrados na CG neurônios CALR que colocalizam com células SOX2 e uma baixa colocalização de neurônios TH e células SOX2. Na CPE, foi observado um baixo número de colocalização de neurônios CALR e CALB e na CCG, as células SOX2 colocalizam com os neurônios CALR. As conclusões mostram que o feto de cão possui uma CRM em direção BOP, com imunorreatividade celular para DCX, SOX2 e GFAP na ZSV e CRM e para CALB, CALR, TH, SOX2 e GFAP nas principais camadas do BOP / Neural precursors originated in the subventricular zone (SVZ) of some animal species have a migration route destined for main olfactory bulb (MOB), where migrants neuroblasts differentiate into olfactory interneurons. This migratory stream is maintained in adulthood. Understanding how it is organized in fetal age is essential for general understanding and establishment of new cell therapies. The aim of this study is characterize the cellular composition and morphological organization of the SVZ and rostral migratory stream (RMS) of brains of canine fetuses. The SVZ, RMS and MOB was obtained from canine fetuses of the approximately 57 gestacional days-old. The tissue was analyzed by Nissl staining and by immunohistochemical methods for double labelling with doublecortin (DCX), transcription factor SOX2, glial fibrillary acid protein (GFAP), calbindin (CALB), calretinin (CALR) and tyrosinehydroxylase (TH). Semiquantitative analysis of immunoreactivity and quantitative analysis of colocalization were realized, besides ultrastructural analysis by electron microscopy. The results show that in dorsal SVZ, DCX immunoreactive cells were found along the ventricular wall, arranged tangentially and lines of SOX2 cells were also found in the same orientation. The GFAP immunostaining is stronger in dorsal SVZ with tangentially directed fibers near the lateral ventricle and radially oriented fibers toward the cortex. The RMS of dog fetus begins at anterior SVZ and follows caudally around the head of the caudate nucleus and vertically descends to bend rostrally into the MOB, where it ends in the granular cell layer (GCL).The RMS have SOX2 positive cells on entire length, showing a homogeneous appearance and high cell density. There is no positive CALB cells or CALR in any region of the SVZ and RMS. The results of the MOB show that the glomerular layer (GL) there were cells immunoreactive to CALR, TH, SOX2 and GFAP. In the external plexiforme layer (EPL) there were immunoreactive cells for CALR, CALB, SOX2 and GFAP and, the GCL, the prevalence is higher for CALR neurons, SOX2-ir and GFAP-ir cells. In colocalization analysis, they were found a some CALR positive neurons in GL that colabeled with SOX2 cells and a low colocalization of TH neurons and SOX2 cells. In EPL, was observed a low colocalization number of CALR and CALB neurons and in GCL, SOX2 cells colabeled with CALR neurons. The conclusions show that the dog fetus has a RMS directed to the MOB, with cellular immunoreactivity for DCX, SOX2 and GFAP in the ZSV and RMS and cellular immunoreactivity for SOX2 CALB, CALR, TH and GFAP in main olfactory bulb layers

Dados da literatura e do nosso grupo evidenciam que a desnutrição protéica compromete órgãos linfo-hematopoéticos e modifica a resposta imune. Sabendo que animais desnutridos apresentam hipoplasia severa de órgãos hematopoéticos e que o microambiente medular apresenta distintos moduladores que atuam sinergicamente para influenciar a sobrevivência, proliferação e o desenvolvimento das células hematopoéticas em todos os seus níveis de diferenciação, avaliamos em um modelo de desnutrição, alguns aspectos da complexa regulação do microambiente medular avaliando a expressão de fatores de transcrição envolvidos no processo de diferenciação da Célula Tronco Mesenquimal (CTM) e capacidade de produção de citocinas importantes para o controle da hematopoese. Camundongos Balb/C machos, adultos, adaptados em gaioleiros metabólicos foram separados nos grupos controles e desnutridos recebendo, respectivamente, ração normoprotéica (12% de proteínas) e hipoprotéicas (2% de proteínas). Após o grupo desnutrido perder cerca de 20% do peso inicial, os animais foram sacrificados para a avaliação nutricional e hematológica caracterizando a desnutrição. As células mesenquimais foram isoladas da medula óssea (MO) e caracterizadas imunofenotipicamente por citometria de fluxo mostrando populações de células em ambos os grupos com marcação positiva para CD90, CD271, Sca1, CD49e, CD13, baixa marcação para CD34 e negativa para CD14, CD45. Na quantificação de fatores de transcrição por Western Blot verificou-se que células mesenquimais medulares de animais desnutridos apresentaram maior expressão de PPARγ e RUNX2, fato este que pode ser explicado, em parte, pelo remodelamento microambiental observado nesses animais. Sobrenadantes de células mesenquimais de animais desnutridos quantificados por Elisa apresentaram uma maior concentração de SCF e uma redução na concentração de G-CSF e GM-CSF. As alterações encontradas nos permitem concluir que a desnutrição compromete as células mesenquimais tanto no aspecto regulatório de fatores de transcrição, bem como na capacidade de produção de citocinas, contribuindo para o comprometimento do microambiente hematopoético e induzindo a falência medular comumente observada em situações de desnutrição protéica. / Data from literature and our group showed that protein malnutrition compromises lympho-hematopoietic organs and modifies the immune response. Knowing that malnourished animals show severe hypoplasia of hematopoietic organs and the bone marrow microenvironment has distinct modulators that act synergistically to influence survival, proliferation and development of hematopoietic cells in all levels of differentiation, we evaluated in a model of protein malnutrition, some aspects of the complex regulation of bone marrow microenvironment evaluating the expression of transcription factors involved in the differentiation of Mesenchymal Stem Cells, and the production capacity of cytokines which are important in the regulation of the hematopoiesis. BALB/c mice, males, adults adapted in metabolic cages were separated in two groups: control and malnourished groups receiving, respectively, normal protein diet (12% protein) and low protein (2% protein). After the malnourished group lost about 20% of initial weight, the animals were sacrificed and evaluated the nutrition status, as well as hematological parameters. Mesenchymal Stem Cells were isolated from bone marrow and immunophenotypically characterized by flow cytometry showing cells populations in both groups stained positive for CD90, CD271, Sca1, CD49e, CD13, low marking for CD34 and negative for CD14, CD45. In the measurement of transcription factors by Western Blot found that Mesenchymal Cells of bone marrow malnourished animals showed higher expression of RUNX2 and PPARγ. This fact can be explained, in part, by microenvironmental remodeling observed in these animals. Mesenchymal stem cells supernatants of malnourished mice quantified by Elisa presented a higher concentration of SCF and a reduced concentration of G-CSF and GM-CSF. The alterations found in malnourished animals allow us to conclude that malnutrition commits Mesenchymal Stem Cells on the expression of transcription factors involved in the regulatory aspects of the differentiation process, as well as at the capacity of cytokine production, contributing to an impaired hematopoietic microenvironment and inducing the bone marrow failure commonly observed in protein malnutrition states.

Introdução: A hipóxia tumoral tem papel de fator prognóstico independente, estando relacionado a fenótipo mais agressivo, com maior capacidade de proliferação, invasão e disseminação metastática, além de maior resistência ao tratamento sistêmico e à radioterapia. As alterações do microambiente decorrente do baixo nível de oxigênio pode levar a formação de células tronco tumorais (CTTs) em células de câncer de mama, que são identificadas através da expressão de aldeído desidrogenase (ALDH1A1). Modelos experimentais para estudo da influência da hipóxia no desenvolvimento e progressão do câncer demonstram dados inconclusivos e controversos e estão limitados a modelos in vitro e modelos in vivo que submetem os camundongos a estado de hipóxia sistêmica. Em nosso estudo, desenvolvemos um modelo in vivo para estudar se o estado de hipóxia controlado, direcionado ao local do tumor, pode induzir a formação de CTT em câncer de mama de camundongos. Métodos: células da linhagem 67 NR foram introduzidas dentro do córtex renal de fêmeas de camundongos BALB/c. Foi colocado um clipe de aneurisma no hilo renal por 60 minutos para provocar hipóxia direcionada ao local do tumor. Os camundongos foram sacrificados após 24 horas ou 7 dias da hipóxia e foi realizada análise histológica para confirmar as mudanças induzidas pela isquemia na córtex renal e tumoral. Realizada dissecção tumoral microscópica e RT-PCR para análise da expressão CA9, HIF1A, HIF2A, Slug, SOX 9 e ALDHA1(TaqMan® Gene Expression Assay) no grupo controle e da hipóxia. TBP e HPRT foram os genes housekeeping e o crescimento in vitro de linhagem de células 67NR, usado como referência. Resultados: Todos os camundongos enxertados com células 67NR no cortex renal desenvolveram tumores locais. Foi observada necrose tubular aguda (NTA), decorrente da hipóxia tecidual direcionada. Os genes foram diferentemente expressos, comparando com as linhagens celulares. Notamos aumento significativo da ativação da via da hipóxia por aumento da expressão gênica de CA9, HIF1A e HIF2A. Ocorreu uma modulação para formação de CTTs. Obervamos aumento de 2,9 e de 5,7 respectivamente, na expressão de SLUG, relação SLUG/SOX9 após 24 horas de hipóxia, redução de 2,7 vezes na expressão de SOX9 e não houve aumento na expressão de ALDH1. Entretanto, houve aumento de 2,1 vezes na expressão de ALDH1 7 dias após a hipóxia. Conclusão: Houve aumento da expressão de Slug e Slug/SOX9 precocemente ao aumento da expressão de ALDH1, em ambiente de hipóxia tumoral, o que sugere que há probabilidade de participação de Slug e SOX9 na formação de CTTs / The tumoral hypoxia is an independent prognostic factor in many solid malignat tumors. Low oxygen tension has been related to more aggressive phenotype, greater proliferation capacity, increased invasiveness and metastatic dissemination, and resistance to systemic treatment and radiotherapy. Changes in the microenvironment due low oxygen level lead to cancer stem cells formation (CSC) in breast câncer. The aldehyde dehydrogenase (ALDH1) cellular expression has been decribed as a CSC marker. Experimental models to study the influence of hypoxia on the development and progression of cancer have shown inconclusive and controversial data and are restricted to models in vitro and in vivo models in mice undergoing a state of systemic hypoxia. In our study, we developed an in vivo model to study whether the state of hypoxia controlled targeted to the tumor site may induce the formation of CSC in breast cancer in mice. Methods: 67 NR lineage cells were engrafted into the renal cortex of female BALB / c mice. Aneurysm clip was placed in the renal hilum for 60 minutes to induce hypoxia targeted to the tumor site. Mice were sacrificed after 24 hours or 7 days of hypoxia, and histological analysis was performed to confirm ischemia-induced renal cortex changes. Tumors were microdissected and RT-PCR was carried out to analyze the expression of CA9, HIF1A, HIF2A, Slug, Sox 9 and ALDHA1 genes (TaqMan® Gene Expression Assay) in the control and hypoxia groups. TBP and HPRT were used as housekeeping genes and the cell lines 67NR gowing in culture plate was used as reference. Results: All mice engrafted with cells in the renal cortex 67NR developed local tumors. Acute tubular necrosis (ATN) was observed, resulting from the targeted tissue hypoxia. The genes were expressed differently, compared with cell lines. We notice a significant increase in activation of the hypoxia by increased gene expression of CA9, HIF1A and HIF2A, 24 hours after renal tumor ischemia. There was increased by 2.9 and 5.7 fold, respectively, in the expression of SLUG and SLUG/SOX9, no difference in ALDH1 and reduced by 2.7 fold in the expression of SOX 9, 24 hours after ischemia.There was increased by 2.1 fold in ALDH1 expression 7 days after ischemia. Conclusion: There was increased in expression of SLUG and SLUG/SOX9 early expression of ALDH1 in tumor hypoxia environment. This suggests are likely SLUG and SOX9 have role in cancer stem cell transformation

O pelo é uma característica dos mamíferos: na maioria das espécies, juntamente com a pele, a pelagem reveste externamente o corpo, com exceção de algumas regiões bem delimitadas. O pelo do cão e demais mamíferos apresenta formato distinto de acordo com a região do corpo. O estudo da obtenção e caracterização de células-tronco em cães poderá ampliar as possibilidades terapêuticas, mediante a utilização das células indiferenciadas na reparação capilar e lesões da pele e seus anexos. Neste trabalho foram utilizadas amostras de folículo piloso retiradas da região rostral de fetos caninos correspondentes a três fases gestacionais distintas (grupo I= 30 dias de gestação; grupo II= 35 dias de gestação; grupo III= 40 dias de gestação).Estas amostras foram cultivadas em placas de Petri de 75 cm² com 5mL de meio de cultivo DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de antibióticos estreptomicina/penicilina. As células obtidas foram congeladas e descongeladas e utilizados nos procedimentos de, análise da expressão dos marcadores de células-tronco: STRO-1, CD 117, OCT 3/4, CD 90, Nanog, CD- 34, SSEA-4, CD -105, MCP-1, HSP- 47, CD 1 A, VEGFR1, DR4, IL- 1 β, caspase3, Ki- 67, CD -45. A escolha dos anticorpos marcadores de células-tronco foi baseada em estudos que mostraram afinidade e avidez com o folículo piloso. Utilizamos também para a caracterização do folículo piloso, a imunohistoquímica e análise de PCR com o marcador S100 e a imunocitoquímica com os marcadores OCT 3/4, VEGF, STRO-1, CD117 e Nanog. Os resultados obtidos sugerem que a linhagem celular do folículo piloso de fetos de cães apresentaram crescimento satisfatório com a utilização do meio DMEM-hight suplementado com 10% de SFB inativado e 1% de antibióticos, sendo mantidas e expandidas em cultivo. O crescimento e a expansão das células-tronco do folículo piloso são peculiares, pois, sua expansão ocorre em torno da haste pilosa, utilizando-a como ancoragem. Os resultados indicaram características de pluripotência nas células-tronco do folículo piloso pela expressão dos marcadores OCT3/4, Nanog, CD105, CD90, SSEA-4, e STRO-1, em todos os grupos analisados. Considerando, a taxa de proliferação, a fase do ciclo celular, distribuição e aspectos de morte celular não foram encontradas diferenças significantes na expressão dos marcadores HSP47, DR4. Para verificar a angiogêneseforam utilizados os marcadores VEGFR1, Ki-67 e caspase-3, sendo expressos em todos os grupos. Na imunohistoquímica e análise de PCR observou-se a expressão da proteína S100, sendo maior nas células do grupo de fetos com 40 dias de gestação- grupo III. Neste estudo, podemos concluir que o conjunto de marcadores expressos nos diferentes grupos de células tronco obtidas das vibrissas de fetos caninos indicaram a expressão de marcadores de pluripotência das células-tronco do folículo piloso / Hair is a characteristic of mammals, since in most species the coat spreads throughout the body, except for some well-defined regions. Mammals in general, including dogs, have different characteristics in their coat according to the region of the body. The study of obtainment and characterization of stem cells from the hair follicle could contribute to new therapeutic possibilities, particularly in the treatment of hair, skin and it appendices injuries. In this study, hair follicle samples were harvestedin the rostral region of canine fetuses, divided into three distinct groups, according to the stage of pregnancy, as follows: Group I = 30 days, Group II = 35 days, Group III = 40 days. These samples were grown in 75 cm² Petri dishes with 5 mL of DMEM culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics 1% streptomycin / penicillin. Cells were frozen and thawed and used in procedures for analysis of expression of markers of stem cells: STRO-1, CD 117, OCT 3/4, CD 90, Nanog, CD- 34,SSEA -4,CD- 105, MCP-1, HSP-47, CD 1 A, VEGF-R1, DR4, IL-1 β, caspase-3, Ki-67, CD -45. The choice of antibodies was based on studies that showed affinity and avidity to the hair follicle. In addition, for purposes of characterization of the hair follicle, procedures for immunohistochemistry and PCR analysis with the marker S100 and immunocytochemistry with the markers OCT3/4, VEGF, STRO-1, CD117 e Nanog were used. The results suggested that hair follicle cell line of fetal dogs showed satisfactory growth using the DMEM high medium supplemented with 10% inactivated FBS and 1% antibiotics and could be maintained and expanded in culture. The growth and expansion of stem cells of the hair follicle are unique because they occur around the hair shaft using it as anchorage. Results also indicated pluripotency features in the hair follicle stem cells through the positive expression of Oct3/4, Nanog, CD105, CD90, SSEA-4 and STRO-1, in all groups. Regarding the proliferation rate and cell cycle phase, distribution and cell death aspects, HSP47, DR4 were used. To verify angiogenesis, VEGFR1, Ki67 and Caspase-3 were expressed in all groups. In Immunohistochemistry procedures we observed the expression of S100, and in mRNA on RT-PCR. We concluded in this study that in group III the expression of S100 was higher than in the two other groups. In addition, we found that the pluripotency of the stem cells was indicated by the expression of the markers OCT3/4, Nanog, CD105, CD90, SSEA-4 and STRO-1

A inserção de fatores de transcrição conhecidos em células somáticas é capaz de reprograma-las levando a um estágio de pluripotência, gerando células-tronco pluripotentes induzidas (iPS). A utilização destas células na medicina regenerativa tem grande potencial tanto na medicina humana quanto na veterinária, e a influência da origem da célula somática utilizada na geração de iPS é discutida atualmente. Mamíferos domésticos, como por exemplo o equino, são bons modelos para o estudo para medicina humana e veterinária, com destaque para terapia celular utilizando células mesenquimais em lesões ortopédicas e articulares. Tendo como hipótese que células equinas com diferentes origens apresentam potenciais de indução à pluripotência e capacidade de diferenciação in vitro variáveis; esta proposta tem como objetivo gerar células iPS equinas obtidas através da transdução viral dos fatores de transcrição OSKM humanos ou murinos em fibroblastos (eFibro) adultos e células mesenquimais derivadas de tecido adiposo (eAdMSC), medula óssea (eMO) e tecido de cordão umbilical (etCU). Foram isoladas e cultivadas 4 linhagens de células do tecido de cordão umbilical, 3 linhagens de fibroblastos equinos, 3 linhagens de células mesenquimais de tecido adiposo equinas e 2 linhagens de células de medula óssea equina. Essas células tiveram seu tempo de duplicação celular calculado em horas (eMO 61,3±15; etCU 53,8±5; eFIBRO 27±2; eAdMSC 18,2±4,5) e foram caracterizadas por diferenciação condrogênica, osteogênica e audiogênica e por imunofenotipagem. A partir destas células foram produzidas 85 linhagens iPS equinas (eiPS- 30 linhagens derivadas de fibroblasto, 33 linhagens derivadas de células de tecido adiposo, 21 linhagens derivadas de células de tecido de cordão umbilical com os fatores humanos e 1 linhagem de derivada de células de tecido adiposo com os fatores murinos). Testes de detecção de fosfatase alcalina e OCT4 foram realizados para células eiPS obtidas de cada linhagem e as células eiPS derivadas de tecido adiposo e fibroblastos foram positivas para detecção de NANOG, TRA1-60, TRA1-81 e as células eiPS derivadas de eAdMSC foram positivas para detecção de SSEA-1. As células eiPS derivadas de cada tipo celular geraram corpos embrióides, que posteriormente foram dissociados para teste de diferenciação espontânea in vitro. Os resultados mostram que células equinas podem ser mais facilmente reprogramadas com fatores humanos quando comparadas com os fatores murinos (P<0.05). Enquanto os fatores murinos produziram apenas uma linhagem de células iPS derivada de eAdMSC, os fatores de reprogramação humanos foram capazes de produzir variadas linhagens de células iPS, sendo a formação de colônias mais eficiente para células derivadas de eAdMSC (322, P<0.01) do que para células derivadas de eFibro (65) e etCU (58), que não diferiram (P=0.95), e não foi possível produzir células eiPS a partir de eMO. Usando o sistema de indução à pluripotência padronizado em nosso laboratório, a utilização de fatores humanos na reprogramação direta gera uma maior eficiência na produção de células iPS equinas quando comparados com fatores murinos. No nosso conhecimento, este é o primeiro relato de células eiPS produzidas unicamente dependentes de bFGF, sem necessidade de adição de LIF no meio de cultivo. / The insertion of known transcription factors into somatic cells is capable of reprogramming them into a pluripotency stage, generating induced pluripotent stem cells (iPS). The influence of the origin of the somatic cell used in the generation of iPS is currently discussed, and the use of these cells in regenerative medicine has great potential in both human and veterinary medicine. Domestic mammals, such as the equine are great models for the study of human and veterinary medicine, highlighting cell therapy using mesenchymal cells in orthopedic and articular injuries. Hypothesizing that equine cells derived from different tissues show variable pluripotency induction potentials and in vitro differentiation capacity, depending on the source of derivation; this proposal aims to generate equine iPS cells obtained by viral transduction of human or murine OSKM transcription factors in adult fibroblasts (eFibro) and mesenchymal cells derived from adipose tissue (eAdMSC), bone marrow(eMO), umbilical cord tissue (etCU). Four umbilical cord tissue cell lines, three equine fibroblast cells lines, three equine adipose tissue mesenchymal cell lines and 2 equine bone marrow cell lines were isolated and cultured. These cells had their doubling time calculated in hours (eMO 61.3 ± 15, etCU 53.8 ± 5, eFIBRO 27 ± 2, and ADMSC 18.2 ± 4.5) and were characterized by chondrogenic, osteogenic and adipogenic and by immunophenotyping. From these cells, 85 equine iPS (eiPS) cell lines were produced (30 fibroblast-derived cell lines, 33 cell lines derived from adipose tissue cells, 21 cell lines derived from umbilical cord tissue cells, with human factors and 1 cell line derived from eAdMSC using murine factors). Alkaline phosphatase and OCT4 detection tests were performed on eiPS cells obtained from each cell line and eAdMSC and eFibro derived iPS cells were positive for the detection of NANOG,TRA1-60, TRA1-81 and eiPS derived from eAdMSC were positive for SSEA-1 detection. Embryonic bodies, which were later dissociated for spontaneous differentiation test in vitro were derived from each cell type. Results show that equine cells can be more easily reprogrammed with human factors when compared to murine factors (P<0.05). While murine factors produced only one eiPS cell line derived from eAdMSC, human reprogramming factors were able to produce multiple eiPS cell lines, and colony formation was more efficient for cells derived from eAdMSC (322 P <0.01) than for cells derived from eFibro (65) and etCU (58), which did not differ (P = 0.95) and It has not yet been possible to produce iPS cells from the eMO cell lines. Using the induction system standardized in our laboratory, the use of human factors in direct reprogramming results in greater efficiency in the production of equine iPS cells when compared to murine factors. To our knowledge, this is the first report of eiPS cells produced solely dependent on bFGF, without the need for addition of LIF in the culture medium.

Ao longo da vida reprodutiva dos machos, espermatozoides são formados pelas células-tronco espermatogoniais (SSCs, do inglês spermatogonialstemcells) por um processo conhecido como espermatogênese. O cultivo in vitro de SSCs abriu novas possibilidades para a preservação da linhagem germinativa, porém os protocolos requerem a adição de fatores de crescimento e exige a manutenção dessas células por um tempo prolongado, fazendo da criopreservação de SSCs uma alternativa para esse problema. A literatura científica ainda não definiu uma metodologia que seja eficaz na congelação das SSCs. O presente estudo teve por objetivo avaliar duas metodologias de vitrificação de tecido testicular de murinos. Para testar esse objetivo, testículosde camundongos da linhagem C57BL6 GFP+ com 8 a 10 dias de idade foramsubmetidos a dois protocolosde vitrificação de tecido testicular descritos na literatura (Protocolo EG+Sacarose e ProtocoloEG+DMSO+BSA). Após 4 a 12 semanas, os testículos vitrificados foram descongelados e as células testiculares dissociadas para avaliação da viabilidade e concentração. As SSCs foram selecionadas por meio de separação celular por \"beads\" magnéticas (MACS) com anticorpoThy1.2 e transplantadas para testículos de camundongos adultos da linhagem C57BL6 previamente tratados com o quimioterápico busulfan. Após seis semanas, os testículos destes animais foram coletados e os túbulos seminíferos dissociados para avaliação da formação de colônias pelas SSCs transplantadas. Houve diferença estatística (p<0,0001) na viabilidade das células entre o Protocolo EG+Sac e Protocolo EG+DMSO+BSA, sendo de 74,4% e 82,8%, respectivamente. Também houve diferença estatística (p<0,0001) na concentração de células obtidas entre o Protocolo EG+Sace Protocolo EG+DMSO+BSA, sendo de 0,43x106 e 1,35x106, respectivamente. Colônias formadas pelas SSCs transplantadas foram encontradas nos testículos dos animais transplantadas para os dois protocolos de vitrificação. De forma descritiva, podemos relatar queo número de colônias observadas para as células do Protocolo EG+DMSO+BSA foi maior comparado ao Protocolo EG+Sac. Portanto, conclui-se que os protocolos de vitrificação de tecido testicular de camundongos estudados foram capazes de preservar a viabilidade de células-tronco espermatogoniais possibilitando a formação de colônias por estas, sendo que o ProtocoloEG+DMSO+BSA de vitrificação foi mais eficiente. / Throughout the reproductive life of males, spermatozoa are formed by spermatogonial stem cells (SSCs) by a process known as spermatogenesis. The in vitro culture of SSCs created new possibilities for preservation of the germ line, but the protocols require the addition of growth factors and require the maintenanceof these cells for a prolonged time, making of the SSCs cryopreservation an alternative for this problem. The scientific literature has not yet defined a methodology that is effective in the freezing of SSCs. The present study aimed to evaluate two methodologies of vitrification of murine testicular tissue. To test this aim, testes of mice of the C57BL6 GFP + strain with 8 to 10 days old were submitted to two protocols of testicular tissue vitrification(Protocol EG+Sucrose and EG+DMSO+BSA). After 4 to 12 weeks, the vitrified testes were thawed and the testicular cells dissociated for viability and concentration assessment. The SSCs were selected by magnetic-activated cell sorting (MACS) using Thy1.2 antibodyand transplanted to testes of adult mice of the C57BL6 strainpreviously treated with thequimioterapicbusulfan. After six weeks, the testes of these animals were collected and seminiferous tubules dissociated to evaluate the formation of colonies by transplanted SSCs. There was a statistical difference (p<0.0001) in cell viability between Protocol EG+Suc and Protocol EG+DMSO+BSA, being 74.4% and 82.8%, respectively. There was also a statistical difference (p<0.0001) in the concentration of cells obtained between Protocol EG+Suc and Protocol EG+DMSO+BSA, being 0.43x106 and 1.35x106, respectively. Colonies formed by the transplanted SSCs were found in the testes of the transplanted animals for the two vitrification protocols. In a descriptive way, we can report that the number of colonies observedfor Protocol EG+DMSO+BSA cells was higher compared to the Protocol EG+Suc. Therefore, it is concluded that the mice testicular tissue vitrification protocols studied were able to preserve the viability of spermatogonial stem cellsallowing the formation of colonies by these cells and the vitrification ProtocolEG+DMSO+BSA was more efficient.

Células germinativas embrionárias são células pluripotentes derivadas das células germinativas primordiais que surgem no período do desenvolvimento embrionário. Sendo precursoras na maturação dos gametas sendo para a proliferação e formação de novas gerações de células germinativas. Estudos em modelos animais com células troncos embrionárias pluripotentes têm sido realizados com sucesso no tratamento de muitas doenças genéticas, principalmente em modelos caninos devido a homologia com humanos. Portanto, objetivamos estabelecer um estudo da biologia das células erminativas caninas para futuras pesquisas, visando sua viabilidade terapêutica. Foram utilizadas fêmeas de cães sem raça definida (SRD), foram submetidas à ovario-salpinge-histerectomia, oriundas de campanhas de castração realizadas por associações e/ou organizações não governamentais na cidade de Pirassununga. Os embriões coletados foram analisados através de um cronograma histológico e também mensurados através da medida Crown-Rump(CR), em seguida em condições ésteres micro-dissecados na região paramesonéfrica próximo a região dos somitos. Os fragmentos foram isolados e colocados em cultivo com meio apropriado para o desenvolvimento e propagação das células germinativas primordiais (PGCs). Obteve-se sucesso nos cultivos com embriões em idades gestacionais próximas a 24 á 32 dias de gestação, nos quais demonstraram uma morfologia arredondada, pequena. Na microscopia eletrônica de varredura e transmissão observamos tamanhos variados entre as células aderidas umas as outras, mostrando um núcleo bem evidente e em seu citoplasma observou-se diversos tipos de organelas celulares, principalmente mitocôndrias. A análise imunohistoquímica revelou a presença de marcadores Oct4, sugerindo a presença de células pluripotentes e germinativas. Imunofenotípicamente as células através da citometria de fluxo revelou baixa expressão para o marcadore Oct4 enquanto que para os marcadores CD 34, C-Kit houve expressão.RT-PCR mostrou expressão do marcador para pluripotencialidade Oct4 e Sox2 e pela técnica de Western Blotting identificou a expressão da proteína específica para Oct4. Portanto estes achados sugerem com sucesso o estabelecimento de cultivo e proliferação e desenvolvimento das células germinativas primordiais caninas. / Embryonic germ cells are pluripotent cells derived from primordial germ cells which arise during embryonic development. These cells are precursors in the maturation of gametes and for proliferation and formation of new generations of germ cells. Studies using animal models for pluripotent embryonic stem cells have been conducted successfully in the treatment of many genetic diseases, especially using canine models, due the homology between canine and humans. Therefore, we aimed to establish a study of canine biology of germ cells for future research, aiming viability therapy. For this study, we used female mongrel dogs (SRD), which underwent ovary- salpingo- hysterectomy, arising from castration campaigns run by associations and/or NGOs in Pirassununga city. The embryos collected were analyzed using histology methods following the timeline and measure by measuring Crown-Rump (CR) then in an environment without contaminants (sterile) the embryos were micro-dissected focusing in the paramesonephric region near the region of somite where the germ cells are. The fragments were isolated and placed in culture with a specific media for the development and spread of primordial germ cells (PGCs). Success was achieved in cultures with embryos at a gestational age close to 22 to 30th days of gestation, in which the cells showed a rounded morphology and small. In electron microscopy and transmission analyses, sizes were observed between the cells attached to each other, showing a conspicuous nucleus and in the cytoplasm was observed several types of cell organelles, especially mitochondria. Immunohistochemical analysis revealed the positive immunolabeling for Oct4, suggesting the presence of pluripotent cells and germ cells. The analyses using immunophenotyping by flow cytometry showed low expression for Oct4 while for CD34 and C-kit markers had positive expression. RT-PCR showed expression of the pluripotency markers Oct4 and Sox2. By the technique of Western Blotting identified protein expression specific for Oct4. Thus these findings suggest the successful establishment of culture, proliferation and development of primordial germ cells canine.