Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El objetivo del presente estudio fue determinar el efecto de distintas concentraciones de Suero Fetal Bovino (SFB) y Ácido Ascórbico (AA) sobre la diferenciación osteogénica de Células Madre Mesenquimales (CMM) bovinas. Las CMM fueron aisladas desde médula ósea de fetos bovinos, mediante adherencia al plástico y posteriormente cultivadas en los distintos tratamientos. El medio DMEM fue suplementado con dexametasona (100 nM), β-glicerofosfato (10 mM), más concentraciones variables de AA y SFB; 0 mM AA - 0% SFB (T1); 0,1 mM AA - 10% SFB (T2); 0,01 mM AA - 10% SFB (T3); 0,001 mM AA - 10% SFB (T4); 0,1 mM AA - 5% SFB (T5); 0,1 mM AA - 2% SFB (T6). La diferenciación fue analizada al día 21 de cultivo mediante cuantificación de la expresión de los genes osteo-específico Osteocalcina (OCN), pluripotencia (NANOG) y del control endógeno gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) utilizando PCR cuantitativo. La actividad de Fosfatasa Alcalina (FA) fue cuantificada mediante espectrofotometría. El depósito de minerales fue evaluado mediante tinción Von Kossa. En T2 se expresaron los mayores (P<0,05) niveles de ARNm de OCN (33,7 veces la expresión del T1). Los niveles de ARNm de NANOG disminuyeron (P<0,05) en todos los tratamientos suplementados con AA y SFB. La actividad de FA aumentó en CMM suplementadas con SFB y AA a excepción de T4. Se observó una alta intensidad en la tinción Von Kossa en T2. En conclusión, el SFB participa parcialmente en la diferenciación osteogénica, mientras que la suplementación de una alta concentración de AA aumenta la capacidad de diferenciación de las CMM bovinas hacia el linaje osteogénico / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 11100205

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La regulación epigenética es un proceso clave en la expresión génica, participando en silenciamiento y activación de genes durante la diferenciación multilinaje de células madre mesenquimales (CMM). El objetivo del presente estudio fue cuantificar la expresión de enzimas de metilación del ADN (DNMT1, DNMT3A y DNMT3B), metilación de histonas (EZH2) y demetilación de histonas (KDM6A) en CMM fetales bovinas durante la diferenciación in vitro osteogénica, condrogénica y adipogénica. Las CMM fueron aisladas desde médula ósea de fetos bovinos (7-9 meses de gestación, n=3) y cultivadas en presencia de factores de diferenciación. La expresión génica fue cuantificada mediante PCR cuantitativo (Q-PCR). En la diferenciación osteogénica, se detectó al día 24 un aumento (P<0,05) en la expresión de KDM6A comparado al día 0. La expresión de DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, EZH2 y KDM6A fue menor (P<0,05) en CMM diferenciadas el día 7 de cultivo condrogénico en relación al día 0 y al control. Se detectó una disminución (P<0,05) en la expresión de DNMT1 en CMM diferenciadas al día 6 de cultivo adipogénico comparado al día 0. Adicionalmente, durante este cultivo se detectó un aumento (P<0,05) en la expresión de DNMT3A, DNMT3A y EZH2 en CMM diferenciadas los días 12 y 18 de diferenciación, en comparación al día 0. En conclusión, se detectó un aumento de KDM6 durante la diferenciación osteogénica, y un aumento de todas las enzimas evaluadas durante la diferenciación adipogénica. En contraste, no se detectó aumento de enzimas durante la diferenciación condrogénic / Proyecto FONDECYT 11100205

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las células madre mesenquimales (CMM) son células indiferenciadas adultas, capaces de diferenciarse hacia múltiples tipos celulares incluyendo los linajes osteogénico, condrogénico y adipogénico. Previamente se han caracterizado CMM de varias especies como la humana, murina, ovina y felina entre otras. El presente estudio tuvo como objetivo el aislamiento de CMM desde médula ósea (MO) fetal bovina y la diferenciación adipogénica de CMM bajo condiciones in vitro durante 18 días. Las CMM fueron aisladas desde MO en base a su capacidad de adherencia al plástico. Las CMM fueron analizadas por PCR cuantitativo (Q-PCR) los días 0, 6, 12 y 18 para cuantificación de los genes endógenos GAPDH y β-ACTINA, de diferenciación adipogénica PPARγ-2, AP-2 y de pluripotencia NANOG. Se determinó un aumento (P<0,05) en los niveles de ARNm de AP-2 en CMM diferenciadas los días 12 y 18 de cultivo (16,4 y 17 veces la expresión del día 0 y 2,2 y 5,1 veces la expresión del día 0 en los controles sin tratamiento). La expresión de PPARγ-2 y NANOG no mostró diferencias significativas entre tratamientos o días de cultivo. La expresión de la proteína PPARγ-2 fue detectada mediante inmunofluorescencia indirecta en las CMM diferenciadas el día 18 de cultivo. La adipogénesis fue confirmada en CMM diferenciadas por medio de la detección de vacuolas lipídicas. En base a estos resultados, se puede concluir que es posible aislar CMM bovinas desde MO fetal en base a su capacidad de adherencia al plástico. Las CMM obtenidas desde MO fetal bovina poseen el potencial de diferenciación adipogénica bajo condiciones in vitro / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1100205

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / Las células madre mesenquimáticas (MSC) pueden ser candidatas adecuadas para la derivación de gametos in vitro debido a su abundancia y a su alto potencial de diferenciación. La diferenciación de las células germinales es un proceso complejo que requiere tanto de regulación endocrina y auto-paracrina en un entorno específico, como de interacciones directas celulares proporcionadas por las células somáticas del testículo. Las células de Sertoli (CS) juegan un papel esencial formando nichos para las células germinales y proporcionando factores esenciales para su diferenciación. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del co-cultivo de CS en la diferenciación de MSC derivadas de tejido adiposo (MSC-TA) y medula ósea (MSC-MO) fetales bovinas hacia linaje de células germinales. Las CS fueron aisladas desde parénquima de testículo de toro adulto y fueron caracterizadas mediante cuantificación de la expresión del biomarcador de CS, Wilms tumor 1 (WT1) y de los niveles de mRNA de Receptor de Andrógeno (AR) utilizando citometría de flujo (FC) y PCR cuantitativo (Q-PCR). Las MSC fueron aisladas desde tejido adiposo y médula ósea mediante adherencia al plástico y posteriormente fueron co-cultivadas sobre monocapas de CS durante 21 días. Muestras de cultivos celulares fueron obtenidas cada 7 días y analizadas para determinación de niveles de mRNA de genes endógenos β-ACTINA y GAPDH, genes de pluripotencia OCT4 y NANOG, genes germinales FRAGILIS, STELLA, VASA y genes germinales de macho DAZL, SRY, PIWIL2 y STRA8 mediante Q-PCR. Adicionalmente se evaluó la expresión de Dazl, Nanog y Oct4 mediante FC e IF. Una alta proporción (85,5%±5,5) de CS fueron positivas para WT1. Los niveles mRNA DAZL y PIWIL2 aumentaron el día 14 de diferenciación en co-cultivos de MSC-TA/CS en comparación con los monocultivos y co-cultivos de MSC-MO/CS. Los niveles de mRNA de NANOG fueron activados en MSC-MO y MSC-TA co-cultivadas con CS luego de 7 y 14 días de cultivo. Los niveles de mRNA de OCT4 aumentaron (P<0,05) el día 14 en los co-cultivos de MSC-MO/CS y de MSC-TA/CS en comparación con los monocultivos. Los niveles de mRNA de CD73 aumentaron (P<0,05) en los co-cultivos el día 21 en comparación con los monocultivos de MSC-MO y MSC-TA, mientras los niveles de mRNA de CD105 disminuyeron (P<0,05) en el co-cultivo de MSC-TA/CS al día 21en comparación con el monocultivos de MSC-TA. Adicionalmente, los niveles de mRNA de SCP3 disminuyeron (P<0,05) en los co-cultivos de MSC-MO/CS y de MSC-TA/CS el día 7 y 14 en comparación con el monocultivo de MSC-TA y no se detectó en el día 21. Los patrones de expresión génica en los co-cultivos sugieren que las MSC fetales bovinas poseen potencial de diferenciación germinal y que las MSC-TA fetales bovinas tienen mayor capacidad de diferenciación en comparación a las MSC-MO. Considerando la disminución en la expresión de SCP3 en los co-cultivos, estos resultados sugieren que las MSC alcanzaron un estado de diferenciación germinal premeiótico temprano / Mesenchymal stem cells (MSC) may be suitable candidates for in vitro gamete derivation due to their abundant source and wide differentiation potential. Germ cell differentiation requires endocrine and auto/paracrine regulation in a specific environment, as well as direct cell-to-cell interactions provided by the somatic cells of the testis. Sertoli cells (SC) play an essential role by forming niches and providing essential factors for germ cell differentiation. The aim of the present study was to evaluate the effect of co-culture of SC on the germ cell differentiation potential of bovine fetal MSC derived from adipose tissue (MSC-TA) and bone marrow (MSC-BM). Sertoli cells were isolated from bull testis parenchyma and characterized by quantification of biomarker wilms tumor 1 (WT1) expression and androgen receptor (AR) mRNA levels using flow-cytometry (FC) and quantitative-PCR (Q-PCR) analyses. bfMSC were isolated from adipose tissue and bone marrow and were co-cultured over monolayers of SC for 21 days. Cell culture samples were obtained every 7 days and analyzed for endogenous genes β-ACTIN y GAPDH, pluripotency genes OCT4 y NANOG, germinal genes FRAGILIS, STELLA, VASA and male germinal genes DAZL, SRY, PIWIL2 and STRA8 using Q-PCR. A high (P < 0.05) proportion of SC (85,5%±5,5) were positive for WT1 and expressed high levels of WT1 and AR mRNA levels. Levels of DAZL and PIWIL2 mRNA were up-regulated at day 14 of differentiation in bfMSC-SC co-cultures compared to monocultures and co-cultures of MSC-BM/CS. NANOG mRNA levels were activated in MSC-BM and MSC-TA co-cultured with SC at days 7 and 14 of culture. OCT4 mRNA levels increased (P <0.05) at day 14 in co-cultures of MSC-BM/CS and MSC-TA/CS compared to monocultures. CD73 mRNA levels increased (P <0.05) in the co-cultures at day 21. CD105 mRNA levels were decreased (P < 0.05) in the co-culture of MSC-TA/CS at day 21 of culture compared to monoculture of MSC-TA. SCP3 mRNA levels were down-regulated in the co-cultures of MSC-BM/CS and of MSC-TA/CS at 14 day compared to monoculture and were not detected at day 21. Thus, the gene expression patterns in MSC suggest that they have the potential for germinal differentiation and that bfMSC-TA have greater differentiation capacity towards germinal lineage in relation to MSC-BM. Moreover, reduction in SCP3 mRNA throughout the process of germinal differentiation suggest that MSC achieved an early premeiotic germ cell differentiation state / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1161251.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las células madre mesenquimales (CMM) son células indiferenciadas con alta capacidad proliferativa y de diferenciación multipotente hacia líneas celulares mesodérmicas que incluyen osteocitos, condrocitos y adipocitos. Estudios recientes indican que las CMM poseen adicionalmente capacidad de diferenciación hacia linajes celulares no mesodérmicos como el hepatogénico. El objetivo del presente estudio fue inducir diferenciación in vitro hepatogénica de CMM aisladas desde médula ósea fetal bovina. Las CMM fueron aisladas en base a su adherencia al plástico desde médula ósea aspirada desde fetos bovinos (n=3) y posteriormente cultivadas in vitro bajo condiciones hepatogénicas por un periodo de 28 días. Durante este periodo se analizó la expresión de los genes hepato-específicos Albúmina (ALB) y α-Fetoproteína (α-FP), de pluripotencia NANOG y la producción de metabolitos hepáticos Glicógeno, Urea y Albúmina. El análisis por PCR cuantitativo (Q-PCR) permitió detectar un aumento (P<0,05) en la expresión de ALB y α-FP (331 y 60 veces el valor del día 0, respectivamente) en CMM diferenciadas el día 28 de cultivo. En esta etapa también se detectaron mayores (P<0,05) niveles de Albúmina (1213 versus 232,9 µg/ml del control) y Urea (8,2 versus 5,5 mg/dl del control) en cultivos de CMM diferenciadas. La presencia de la proteína α-FP y de Glicógeno también fue detectada en estas células. Estos resultados indican que las CMM aisladas desde médula ósea fetal bovina poseen potencial de diferenciación hepatogénico bajo condiciones in vitro / Financiamiento: Proyecto Fondecyt N° 11100205