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Der Einfluss des Tau-Proteins auf die Morphologie von NervenzellenBarbu, Corina 28 November 2012 (has links) (PDF)
Tau ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein, das die Polymerisation von Tubulin fördert und die Mikrotubuli stabilisiert. Folglich wird angenommen, dass Tau essentiell für die neuronale Morphogenese ist, vor allem für die Axonenausbildung und -aufrechterhaltung. Mittels tangentieller Nissl-gefärbter Schnitte von Mäusegehirnen konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Tau-knockout Mäuse die regelhafte thalamokortikale Barthaar-projektion („Barrel“ Konfiguration) entwickeln. Der Einfluss von Tau auf die Entstehung von Dendriten wurde anhand von Golgi-gefärbten Präparaten untersucht. Die Sholl-Analyse der gefärbten CA1-Pyramidenzellen zeigte, dass die Komplexität apikaler Dendriten durch das Fehlen von Tau reduziert wurde, während die Basaldendriten unbeeinflusst blieben. Das Tau-Protein scheint demzufolge unwesentlich für die Entstehung von axonalen Verbindungen im embryonalen Gehirn zu sein, ist aber beteiligt an der Steuerung des dendritischen Verzweigungsmusters. Ferner wurde beobachtet, dass sowohl die adulte Neurogenese, als auch die Mikrotubuli-Stabilität in den Apikal- und Basaldendriten und die Synapsen von dem Fehlen des Tau-Proteins unbeeinflusst blieben. In primären Zellkulturen aus dem Kleinhirn von Tau-knockout und Tau-wildtyp Mäusen konnten zwischen den zwei Genotypen keine signifikanten Unterschiede in der Länge oder im Verzweigungsmuster der Dendriten und der Axone von Körnerzellen beobachtet werden. Die Untersuchung der Effekte einzelner Tau-Isoformen auf die Morphologie von N2A-Zellen zeigte, dass es Unterschiede sowohl zwischen Tau-defizienten und Tau-positiven Zellen, als auch zwischen Zellen mit den verschiedenen Tau-Isoformen gibt. Das Tau-Protein übt demnach in vivo einen wichtigen Einfluss auf die Morphologie der Nervenzellen und besonders der Dendriten aus, welcher in vitro weiter analysiert wurde.
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Einfluss des clostridialen C3 Toxins auf die Dendritenmorphologie und Spinebildung von CA1 Pyramidenzellen in Hippocampus-Schnittkulturen der Maus - eine quantitative lichtmikroskopische UntersuchungHintze, Thorsten 19 November 2010 (has links) (PDF)
Lokale Pyramidenzellen sind die Hauptneurone des Hippocampus und können durch ihre Position und die Morphologie ihrer Dendriten als CA1 und CA3 Pyramidenzellen identifiziert werden. Die Dendriten der exzitatorischen Pyramidenzellen sind mit postsynaptischen Vorwölbungen, den so genannten Spines, bedeckt, welche in einem spezifischen Verteilungsmuster angeordnet sind. Neurotoxine wie das C3 Toxin von Clostridium botulinum sind funktionelle Substanzen, die die neuronale Morphologie verändern und die neuronale Funktion beeinflussen können. In dieser Studie wurden die morphologischen Veränderungen von intrazellulär mit Biocytin gefüllten CA1 Pyramidenzellen qualitativ und quantitativ analysiert. Die hippocampalen Schnittkulturen, in denen sich bekanntermaßen Pyramidenzellen ähnlich entwickeln wie in vivo, wurden dazu herangezogen, die Effekte der C3bot Toxin-Applikation auf die Verzweigung der Dendriten sowie Anzahl und Dichte der dendritischen Spines zu untersuchen. Drei Gruppen von Zellen wurden verglichen: Erstens Neurone, die in serumhaltigem Medium inkubiert worden waren, zweitens Nervenzellen, die in einem Medium ohne Serum inkubiert worden waren und drittens Zellen, die unter Serumentzug dem C3bot Toxin ausgesetzt worden waren. Die Inkubation dauerte 14 Tage, während die Dauer der Toxinexposition zwischen vier und sechs Stunden betrug. Mit Hilfe eines Computers wurden zweidimensionale Nachbildungen der biocytin-markierten CA1 Pyramidenzellen erstellt, und die Gesamtlänge der Dendriten, die Anzahl der dendritischen Verzweigungspunkte und die Gesamtzahl und Dichte der dendritischen Spines gemessen und statistisch ausgewertet. Signifikante Unterschiede wurden zwischen der mit C3 Toxin behandelten Gruppe und der serumhaltig inkubierten Kontrollgruppe beobachtet. Diese signifikanten morphologischen Veränderungen traten selektiv an den Apikaldendriten der toxinbehandelten CA1 Pyramidenzellen auf. Aus der Behandlung resultierte eine Reduktion der Anzahl apikaler Verzweigungspunkte, der Anzahl der apikalen Spines, der Gesamtzahl (basal und apikal addiert) der Spines sowie der Gesamtspinedichte. Im Gegensatz dazu ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen der toxinbehandelten Gruppe und der ohne Serum inkubierten Kontrollgruppe, obwohl der Serumentzug im Vergleich zur serumhaltig inkubierten Kontrollgruppe die Entwicklung der Zellen beeinflusste. Auf Grundlage der beobachteten Veränderungen können wir schließen, dass die Behandlung mit C3 bot einen starken Einfluss selektiv auf die Morphologie der Apikaldendriten ausübt. Der Mechanismus, der dieser selektiven Empfindlichkeit der Apikaldendriten gegenüber dem C3 bot Toxin zugrunde liegt, wird Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
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Der Einfluss des Tau-Proteins auf die Morphologie von Nervenzellen: Der Einfluss des Tau-Proteins auf die Morphologie von NervenzellenBarbu, Corina 01 November 2012 (has links)
Tau ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein, das die Polymerisation von Tubulin fördert und die Mikrotubuli stabilisiert. Folglich wird angenommen, dass Tau essentiell für die neuronale Morphogenese ist, vor allem für die Axonenausbildung und -aufrechterhaltung. Mittels tangentieller Nissl-gefärbter Schnitte von Mäusegehirnen konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Tau-knockout Mäuse die regelhafte thalamokortikale Barthaar-projektion („Barrel“ Konfiguration) entwickeln. Der Einfluss von Tau auf die Entstehung von Dendriten wurde anhand von Golgi-gefärbten Präparaten untersucht. Die Sholl-Analyse der gefärbten CA1-Pyramidenzellen zeigte, dass die Komplexität apikaler Dendriten durch das Fehlen von Tau reduziert wurde, während die Basaldendriten unbeeinflusst blieben. Das Tau-Protein scheint demzufolge unwesentlich für die Entstehung von axonalen Verbindungen im embryonalen Gehirn zu sein, ist aber beteiligt an der Steuerung des dendritischen Verzweigungsmusters. Ferner wurde beobachtet, dass sowohl die adulte Neurogenese, als auch die Mikrotubuli-Stabilität in den Apikal- und Basaldendriten und die Synapsen von dem Fehlen des Tau-Proteins unbeeinflusst blieben. In primären Zellkulturen aus dem Kleinhirn von Tau-knockout und Tau-wildtyp Mäusen konnten zwischen den zwei Genotypen keine signifikanten Unterschiede in der Länge oder im Verzweigungsmuster der Dendriten und der Axone von Körnerzellen beobachtet werden. Die Untersuchung der Effekte einzelner Tau-Isoformen auf die Morphologie von N2A-Zellen zeigte, dass es Unterschiede sowohl zwischen Tau-defizienten und Tau-positiven Zellen, als auch zwischen Zellen mit den verschiedenen Tau-Isoformen gibt. Das Tau-Protein übt demnach in vivo einen wichtigen Einfluss auf die Morphologie der Nervenzellen und besonders der Dendriten aus, welcher in vitro weiter analysiert wurde.:Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Das Mikrotubuli-assoziierte Protein Tau 1
1.2 Bedeutung des Tau-Proteins beim Menschen: Tauopathien 3
1.3 Bedeutung des Tau-Proteins beim Menschen: Mikrodeletion des MAPT-Lokus 4
1.4 Ergebnisse aus bisherigen Studien mit Tau-knockout Tieren 6
1.5 Aufgabenstellung 7
2 Material und Methoden 9
2.1 Material 9
2.1.1 Versuchstiere 9
2.1.2 Chemikalien 9
2.1.3 Häufig verwendete Lösungen 10
2.1.4 Geräte 10
2.2 Histologie 11
2.2.1 Fixierung 11
2.2.2 Golgi-Einzelschnittimprägnierung 11
2.2.3 Gefrierschnitte 11
2.2.4 Nissl-Färbung 12
2.2.5 Immunhistochemische Markierungen 13
2.3 Morphometrie 15
2.3.1 Sholl-Analyse 15
2.3.2 Volumenbestimmung 16
2.3.3 Zellzahl (Neurogenese) 17
2.3.4 Synapsenzahl 17
2.4 Proteinbiochemie 19
2.4.1 Proben 19
2.4.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 19
2.4.3 Western Blot 20
2.4.4 Immundetektion am Western Blot 21
2.5 Transfektion von Nervenzellen in primärer Zellkultur 25
2.5.1 Primäre Zellkultur 25
2.5.2 Transfektion von primären Zellkulturen 25
2.5.3 Morphometrische Analyse von Körnerzellen des Kleinhirns 26
2.6 Klonierung von Tau-Protein-Isoformen 27
2.6.1 Klonierungsstrategie zur Herstellung eines pIRES-DsRed-Tau Vektors 27
2.6.2 Agarose-Gelelektrophorese 30
2.6.3 Gelextraktion der verschiedenen Tau-Isoform-Sequenzen 30
2.6.4 Herstellung chemisch kompetenter E.coli Zellen 31
2.6.5 Chemische Transformation kompetenter E. coli Zellen 32
2.6.6 Animpfen 32
2.6.7 Plasmid-DNA Purifikation aus 15ml Medium („Miniprep”) 32
2.6.8 Schneiden mit Restriktionsendonukleasen 33
2.6.9 Plasmidpräparation aus 100 ml Medium („Midiprep“) 33
2.6.10 Transfektion von N2A-Zellen mit pIRESRed-Tau 34
2.6.11 Rekonstruktion der transfizierten N2A-Zellen 35
2.7 Statistische Auswertung 36
3 Ergebnisse 37
3.1 Thalamokorticale Projektionen 37
3.2 Komplexität der Dendriten von CA1-Pyramidenzellen 37
3.3 Adulte Neurogenese im Hippocampus 41
3.4 Volumen des Hippocampus 43
3.5 Glia 45
3.6 Synapsen 46
3.7 Stabilität der Mikrotubuli 48
3.8 Mikrotubuli-assoziierte Proteine 50
3.9 Entwicklung in vitro 52
3.9.1 Primärkulturen 52
3.9.2 N2A-Zellkultur 54
4 Diskussion 58
4.1 Diskussion der Methoden 58
4.1.1 Herstellung von Tau-knockout Mäusen 58
4.1.2 Golgi-Einzelschnittimprägnierung und die dreidimensionale Zellrekonstruktion 59
4.1.3 Neurogenese 60
4.1.4 Volumenbestimmung von Hippocampus und Gyrus dentatus 61
4.1.5 Synaptische Marker 61
4.1.6 Western Blot 62
4.1.7 Transfektion von primären Zellkulturen 62
4.1.8 Transfektion von N2A-Zellen mit humanen Tau-Isoformen 63
4.2 Vergleich mit bekannten Daten aus der Forschungsliteratur 64
4.2.1 Axonogenese 64
4.2.2 Dendritogenese 64
4.2.3 Mikrotubuli-assoziierte Proteine und Mikrotubuli-Stabilität 67
4.2.4 Neurogenese 67
4.2.5 Synaptogenese 68
4.2.6 Rolle der einzelnen Isoformen 68
4.3 Bedeutung für die Medizin 71
4.4 Fazit 72
5 Zusammenfassung 73
6 Literaturverzeichnis 76
Posterpräsentationen 88
Danksagung 89
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 90
Lebenslauf 91
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Einfluss des clostridialen C3 Toxins auf die Dendritenmorphologie und Spinebildung von CA1 Pyramidenzellen in Hippocampus-Schnittkulturen der Maus - eine quantitative lichtmikroskopische UntersuchungHintze, Thorsten 05 October 2010 (has links)
Lokale Pyramidenzellen sind die Hauptneurone des Hippocampus und können durch ihre Position und die Morphologie ihrer Dendriten als CA1 und CA3 Pyramidenzellen identifiziert werden. Die Dendriten der exzitatorischen Pyramidenzellen sind mit postsynaptischen Vorwölbungen, den so genannten Spines, bedeckt, welche in einem spezifischen Verteilungsmuster angeordnet sind. Neurotoxine wie das C3 Toxin von Clostridium botulinum sind funktionelle Substanzen, die die neuronale Morphologie verändern und die neuronale Funktion beeinflussen können. In dieser Studie wurden die morphologischen Veränderungen von intrazellulär mit Biocytin gefüllten CA1 Pyramidenzellen qualitativ und quantitativ analysiert. Die hippocampalen Schnittkulturen, in denen sich bekanntermaßen Pyramidenzellen ähnlich entwickeln wie in vivo, wurden dazu herangezogen, die Effekte der C3bot Toxin-Applikation auf die Verzweigung der Dendriten sowie Anzahl und Dichte der dendritischen Spines zu untersuchen. Drei Gruppen von Zellen wurden verglichen: Erstens Neurone, die in serumhaltigem Medium inkubiert worden waren, zweitens Nervenzellen, die in einem Medium ohne Serum inkubiert worden waren und drittens Zellen, die unter Serumentzug dem C3bot Toxin ausgesetzt worden waren. Die Inkubation dauerte 14 Tage, während die Dauer der Toxinexposition zwischen vier und sechs Stunden betrug. Mit Hilfe eines Computers wurden zweidimensionale Nachbildungen der biocytin-markierten CA1 Pyramidenzellen erstellt, und die Gesamtlänge der Dendriten, die Anzahl der dendritischen Verzweigungspunkte und die Gesamtzahl und Dichte der dendritischen Spines gemessen und statistisch ausgewertet. Signifikante Unterschiede wurden zwischen der mit C3 Toxin behandelten Gruppe und der serumhaltig inkubierten Kontrollgruppe beobachtet. Diese signifikanten morphologischen Veränderungen traten selektiv an den Apikaldendriten der toxinbehandelten CA1 Pyramidenzellen auf. Aus der Behandlung resultierte eine Reduktion der Anzahl apikaler Verzweigungspunkte, der Anzahl der apikalen Spines, der Gesamtzahl (basal und apikal addiert) der Spines sowie der Gesamtspinedichte. Im Gegensatz dazu ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen der toxinbehandelten Gruppe und der ohne Serum inkubierten Kontrollgruppe, obwohl der Serumentzug im Vergleich zur serumhaltig inkubierten Kontrollgruppe die Entwicklung der Zellen beeinflusste. Auf Grundlage der beobachteten Veränderungen können wir schließen, dass die Behandlung mit C3 bot einen starken Einfluss selektiv auf die Morphologie der Apikaldendriten ausübt. Der Mechanismus, der dieser selektiven Empfindlichkeit der Apikaldendriten gegenüber dem C3 bot Toxin zugrunde liegt, wird Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
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