La libération de l'acide arachidonique (AA) de la membrane des cellules par les phospholipases activées, le rend accessible pour être métabolisé par plusieurs enzymes impliquées dans la biosynthèse des eicosanoïdes. Ceux-ci incluent les cyclooxygénases (COX), les lipoxygénases (LOX) et plusieurs isoformes des cytochromes P450 (CYP450) qui produisent les acides époxy-eicosatriénoïques (EET) et les acides hydroxy-eicosatétraénoïques (HETE). Tandis qu'une attention considérable a été accordée aux rôles des eicosanoïdes dérivés des COX et des LOX, relativement peu de données sont disponibles sur les rôles potentiels des eicosanoïdes produits par les CYP450 sur la réactivité des muscles lisses des voies respiratoires (MLVR). L'objectif général de ce projet était de déterminer les modes d'action de ces eicosanoïdes bioactifs sur les tissus pulmonaires humains. L' idée étant de mieux cerner les mécanismes cellulaires et moléculaires activés lorsque ces tissus sont traités avec différents médiateurs lipidiques (eicosanoïdes) et inflammatoires (cytokines). Pour cela les propriétés électrophysiologiques, pharmacomécaniques et biochimiques susceptibles d'être modulées par ces eicosanoïdes sur les MLVR ont été analysées. Premièrement, nous avons démontré que l'acide 14,15-époxy-eicosatriénoïques (14,15-EET) hyperpolarise et relaxe les MLVR humains via l'activation des canaux potassiques de grande conductance activé par le Ca[exposant]2+ (BK[indice]Ca ). De plus, nous avons démontré que cet époxy-eicosanoïde diminue la sensibilité au Ca[indice]2+ des bronchioles perméabilisées à la [bêta]-escine, ce qui est corrélé avec une baisse du niveau de phosphorylation et d'expression de la protéine CPI-17 (protein kinase C-potentiated myosin phosphatase inhibitor). Par la suite, nous avons mis au point un modèle d'hyperréactivité bronchique (HRB) induit par un prétraitement des tissus au tumor necrosis factor [alpha] (TNF[alpha]). Ce modèle nous a permis d'évaluer les effets anti-inflammatoires des époxy-eicosanoïdes. Nous avons démontré que ces eicosanoïdes interfèrent avec l'activation du Nuclear Factor [kappa] B (NF[kappa]B) via leur interaction avec le peroxisome proliferator-activated receptors [gamma] (PPAR[gamma]). De plus, le 14,15-EET et l'acide 17,18-époxy-eicosatetraénoïque (17,18-EpETE) diminuent l'hypersensibilité au Ca[exposant]2+ des bronchioles prétraitées au TNF[alpha], en interférant avec la voie de signalisation de p38 mitogen-activated protein kinase (p38-MAPK), ce qui entraîne une réduction de la phosphorylation et de l'expression de la protéine CPI-17. L'introduction de siRNA dirigés contre les transcrits de la CPI-17 dans les bronchioles humaines traitées au TNF[alpha] a permis de mettre en évidence le rôle crucial de cette protéine dans l'HRB. Cette étude a aussi permis de démontrer que l'époxyde hydrolase soluble (sEH) est surexprimée dans les bronchioles humaines traitées au TNF[alpha] et dans les biopsies de patients asthmatiques. L'utilisation d'un inhibiteur pharmacologique de la sEH, le 12-(3-adamantyl-ureido)-dodecanoic acid (AUDA), a permis d'augmenter la biodisponibilité des époxy-eicosanoïdes et leurs effets bénéfiques sur les tissus bronchiques traités au TNF[alpha]. Les stratégies expérimentales établies ont permis de définir les modes d'action de ces eicosanoïdes et de démontrer leurs rôles potentiels contre l'HRB.

Regulation of smooth muscle contraction depends on the phosphorylated state of myosin light chain (MLC). Although there are many kinases responsible for phosphorylating MLC, the myosin phosphatase complex is solely accountable for its dephosphorylation. Myosin phosphatase, in turn, is tightly regulated by many proteins. One of them being the CPI-17 gene family, which inhibits myosin phosphatase. This family of proteins is composed of CPI-17 itself, PHI-1, KEPI, and GBPI. Zebrafish have two genes each of CPI-17 and PHI-1, which are expressed during early embryonic development. This study sets out to investigate whether the two isoforms of CPI-17 and PHI-1 have diverged in function or expression using zebrafish as a model organism. Through a series of biochemical tests and assays, we have determined that the two isoforms have diverged in their expression pattern from each other, however they have similar function.

Résumé : Dans les maladies respiratoires chroniques, les propriétés biochimiques et mécaniques des muscles lisses des voies respiratoires (MLVR) ont été analysées, mais les modes d’action des médiateurs lipidiques endogènes dérivés des oméga-3 (époxy- ou polyhydroxy- éicosanoïdes) restent à clarifier. Mon travail de recherche a pour but de caractériser le rôle potentiel de monoacyglycéride de l’acide éicosapentaénoϊque (MAG-EPA) et de monoacylglycéride de l’acide docosahexaénoϊque (MAG-DHA) ainsi que leurs métabolites (acide 17,18-époxyéicosatétraénoϊque : 17,18-EpETE, résolvine D1 : RvD1), sur le statut inflammatoire et l’activité contractile des voies respiratoires mises en culture organoϊde avec des cytokines pro-inflammatoires. Sur des trachées de cobayes (TC) natives précontractées au U-46619 (agoniste du récepteur thromboxane prostanoϊde), le 17,18-EpETE relaxe les tissus de manière plus importante que son précurseur, le MAG-EPA. Dans les TC mises en culture pendant 3 jours, les niveaux de TNF-α ont augmenté dans les fractions microsomales par rapport aux trachées natives. Sur ces tissues cultivés et traités avec 0.3 µM 17,18-EpETE, une réduction de la sensibilité au Ca2+ a été démontrée. De plus, une diminution de niveaux de détection des P-p65-NFκB, c-fos et c-Jun a été quantifiée en présence de 17,18-EpETE et des inhibiteurs de PKC ou Rho kinase lorsque les TC sont préalablement traités par 10 ng/ml TNF-α. Les cytokines pro-inflammatoires (IL-13 et TNF-α, etc…) jouent un rôle majeur dans la physiopathologie de l’asthme. Le projet de bronchioles humaines évalue l’effet de la RvD1 et de ses précurseurs (MAG-DHA, MAG-DPA et 17(S)-HpDoHE) sur le statut inflammatoire et la bronchoréactivité, in vitro. Dans les bronchioles stimulées par l’IL-13 pendant 48 h, le MAG-DHA ainsi que ces métabolites diminuent l’activation de la voie TNF-α/NFκB et la sensibilité au Ca2+ des tissus prétraités avec l’IL-13 vers des niveaux proches des conditions contrôles. Dans les bronchioles prétraitées par le TNF-α, l’inflammation et l’hypersensibilité au Ca2+ sont abolies par 1 µM MAG-DPA. De plus, l’aspirine combinée au MAG-oméga-3 potentialise les effets inhibiteurs de ce dernier sur l’inflammation et l’hyperréactivité bronchique induite par les cytokines, tout en régulant à la hausse les niveaux de détection du GPR-32 (le récepteur de RvD1). En conclusion, les dérivés des oméga-3 à longue chaîne pourraient résoudre l’inflammation et contrer les causes de l’hyperréactivité bronchique (HRB). / Abstract : In chronic respiratory diseases, the biochemical and mechanical properties of airway smooth muscle were analyzed, but the mode of action of omega-3 derivatives (epoxy or polyhydroxy-eicosanoids) remains to be clarified. My research work aims to characterize the potential role of eicosapentaenoic acid monoacyglyceride (MAG-EPA) and docosahexaenoic acid monoacylglyceride (MAGDHA) and their bioactive metabolites (17,18-epoxyeicosatetraenoic acid: 17 18-EpETE, resolvin D1: RvD1) on the inflammatory status and the contractile activity of organcultured airway explants with pro-inflammatory cytokines. On 30 nM U-46619 (Thromboxane prostanoid receptor agonist) pre-contracted fresh guinea pig trachea, 17,18 EpETE displays a greater ability than its precursor, MAG-EPA to relax airways. In 72-h-cultured tracheal rings, TNF-α levels increase in the microsomal fractions when compared to native trachea. In cultured and pre-treated tracheal rings with 0.3 µM 17,18-EpETE, the Ca2+ hypersensitivity is alleviated in comparaison to 3 day cultured tracheal rings. In addition, the detection levels of P-NFκB, c-fos and c-Jun were abolished in the presence of 17,18-EpETE and PKC or Rho kinase inhibitors in short term-TNF-α- incubated tracheal rings. Pro-inflammatory cytokines (IL-13, TNF-α, etc…) play a major role in asthma pathophysiology. The human bronchi project evaluates the effect of RvD1 and its precursors (MAG-DHA, MAG-DPA and 17 (S)-HpDoHE) on the inflammatory status and bronchial reactivity, in vitro. In IL-13 stimulated human bronchi for 48 h, the MAG-DHA and its metabolites decrease the activation of TNF-α / NFκB pathway and blunt the Ca2+ hypersensitivity triggered by IL-13. In TNF-α-pretreated human bronchi, airway inflammation and Ca2+ hypersensitivity are reversed by 1 µM MAG-DPA. Hence, aspirin combined with MAG-omega-3 potentiate the inhibitory effects of MAG-DHA on inflammation and bronchial hyperrresponsiveness triggered by pro-inflammatory cytokines, while upregulating the GPR-32 detection levels (RvD1 receptor). In conclusion, omega-3 derivatives could counteract the causes of airway hyperrresponsiveness (AHR).