Der Keratokonus ist eine Erkrankung, bei der sich die Hornhaut des Auges, auch als Cornea bezeichnet, fortschreitend ausdünnt. Dies führt zu einer Formveränderung und damit zu Einschränkungen des Sehvermögens. Bei den Betroffenen tritt häufig Kurzsichtigkeit auf, die aufgrund der unregelmäßigen Wölbung der Cornea nur schwer durch Sehhilfen ausgeglichen werden kann. In schweren Fällen ist eine Hornhauttransplantation erforderlich. Die Ursachen der Erkrankung sowie der Einfluss äußerer Faktoren auf den Krankheitsverlauf sind bislang nicht hinreichend erforscht, sodass eine Prognose schwierig ist. Quervernetzungen (Crosslinks) im Kollagen spielen eine entscheidende Rolle für die optischen und biomechanischen Eigenschaften der Cornea. Therapeutische Ansätze zielen darauf ab, zusätzliche Crosslinks zu erzeugen und damit das Gewebe zu stabilisieren. Die photochemische Vernetzung der Cornea (engl. Corneal Crosslinking, CXL) mit Riboflavin und UV-Licht wurde entwickelt, um die biomechanischen Eigenschaften der Cornea zu verbessern und dem Fortschreiten des Keratokonus entgegenzuwirken. Es wird angenommen, dass die UV-Bestrahlung Riboflavin aktiviert, welches daraufhin Sauerstoffmoleküle in der Cornea in hochreaktive Formen umwandelt. Diese reaktiven Sauerstoffspezies initiieren chemische Reaktionen, welche zur Bildung neuer Crosslinks zwischen den Kollagenfasern führen. Obgleich makroskopische Effekte wie eine erhöhte Gewebesteifigkeit, eine erhöhte Resistenz gegenüber enzymatischem Abbau sowie Veränderungen in der Fibrillenarchitektur dokumentiert sind, existieren nur wenige Studien, welche die CXL auf molekularer Ebene untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit werden die molekularen Mechanismen der CXL in der Cornea mit schwingungsspektroskopischen Methoden wie Infrarot- (IR) und Raman-Spektroskopie untersucht. Diese Methoden bieten eine hohe Sensitivität gegenüber kleinsten molekularen Veränderungen und ermöglichen die Untersuchung von Gewebe in nahezu nativem Zustand. Die Experimente wurden an vom Schwein stammenden Corneae durchgeführt, da diese über eine große Ähnlichkeit mit der humanen Cornea verfügen. Zum Nachweis der kovalenten Bindungen wurden IR-Imaging-Messungen an Dünnschnittpräparaten und ATR-spektroskopische Experimente (engl. attenuated total reflection) durchgeführt. Letztere ermöglichten die oberflächennahe Detektion molekularer Veränderungen in situ, d. h. zeitgleich mit der UV-Bestrahlung. Die Messungen zeigen gemeinsame spektrale Veränderungen, insbesondere im Amid-I- und Amid-II-Bereich, sowie eine Zunahme der C–O-Schwingungen. Aufgrund der im Rahmen dieser Arbeit gesammelten ATR-spektroskopischen Daten kann insgesamt davon ausgegangen werden, dass eine Kombination mehrerer Effekte zu einer Verstärkung der Biomechanik durch die CXL führt. Die ATR-Spektren liefern keine eindeutigen Hinweise für die Entstehung neuer kovalenter Bindungen, die durch einen einheitlichen Reaktionsmechanismus (z. B. Addition von Stickstoffbasen an Carbonylgruppen, Vernetzung via Histidinseitenketten) erklärt werden können. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Raman-Spektroskopie als ergänzende Methode zur Untersuchung der CXL eingesetzt. Durch den zusätzlichen Einsatz der SERS-Messtechnik (engl. surface-enhanced Raman spectroscopy) sollten gezielt oberflächennahe Reaktionsprodukte, die durch die CXL gebildet werden, hervorgehoben werden. Da SERS spezielle Strukturen für die Oberflächenverstärkung benötigt, wurden Cornea-Proben nach der CXL-Behandlung mit Silber bedampft und anschließend untersucht. Die systematische Auswertung der Messungen zeigte vor allem Veränderungen in den Bereichen, die mit Prolin und Hydroxyprolin sowie CH2/CH3-Gruppen assoziiert sind. Darüber hinaus zeigen die Untersuchungen, dass Vernetzungssignale bereits ohne Bestrahlung auftreten, die Vernetzungsbehandlung jedoch nicht bei jeder individuellen Behandlung bzw. Cornea zu einem nachweisbaren Effekt führt. Die Ergebnisse werfen ein neues Licht auf die Funktionsweise der CXL und erfordern eine Neubewertung bisheriger Annahmen über mögliche Reaktionsmechanismen. Aufgrund fehlender Hinweise können kovalente Bindungen als primäre Quelle für die Erhöhung der Stabilität der Cornea ausgeschlossen werden. Die Stabilisierung der Cornea durch die CXL lässt sich vermutlich auf eine Kombination von physikalischen, chemischen und strukturellen Veränderungen zurückführen. Es ist davon auszugehen, dass nicht-kovalente Interaktionen wie Dipolwechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Kollagenmolekülen einen weitaus größeren Beitrag zur erhöhten biomechanischen Stabilität der Cornea leisten als bisher angenommen.:1. Einleitung 1.1 Hintergrund und Motivation 1.2 Zielsetzung 2. Cornea und Keratokonus 2.1 Aufbau und Funktion der Cornea 2.2 Zusammensetzung der Cornea 2.3 Molekularer Aufbau des Kollagens in der Cornea 2.4 Kollagen-Crosslinks 2.4.1 Enzymatische Crosslinks durch Lysyloxidase 2.4.2 Nicht-enzymatische Crosslinks durch Glykierung 2.5 Keratokonus 3. Therapie CXL 3.1 Die Funktion von Riboflavin, UV-Licht und Sauerstoff 3.2 Methoden zur Untersuchung der CXL 3.3 Stand der Forschung zur Untersuchung der CXL 4. Material und Methoden 4.1 Präparation der untersuchten Proben 4.1.1 Präparation der Cornea-Flaps 4.1.2 Präparation der Dünnschnittpräparate 4.2 CXL nach dem Dresden-Protokoll 4.3 Vernetzungsbehandlung mit Glutaraldehyd 4.4 Chemikalien 4.5 Transmissions-IR-Mikrospektroskopie 4.6 ATR-Spektroskopie 4.7 Oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) 4.8 Konfokale Raman-Messungen 4.9 Datenvorbehandlung 5. Ergebnisse und Diskussion 5.1 IR-mikroskopisches Imaging der Cornea 5.2 ATR-spektroskopische Untersuchung der CXL 5.2.1 Messungen der CXL unter in-situ-äquivalenten Bedingungen 5.2.2 Entwicklung eines Aufbaus zur ATR-Messung mit Sauerstoffzufuhr 5.2.3 Ergebnisse der ATR-Messungen unter erhöhter Sauerstoffzufuhr 5.2.4 Fazit 5.3 Raman-spektroskopische Untersuchung der CXL 5.3.1 Raman-Spektrum der Cornea 5.3.2 Raman-Messungen der CXL an Cornea-Flaps 5.3.3 Raman-Messungen der CXL von ganzen Augen 5.3.4 Oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie 5.3.5 Abscheidung der Silberschicht 5.3.6 Ergebnisse der SERS-Experimente 5.3.7 Raman-Messungen der Vernetzung mit Glutaraldehyd 5.3.8 Fazit 6. Zusammenfassung 7. Literaturverzeichnis 8. Anhang Veröffentlichungen Versicherung