Un requisito básico para cualquier programa de mejoramiento basado en la selección asistida por marcadores (MAS) es contar con un adecuado número de marcadores polimórficos. Entre toda la variedad de marcadores moleculares disponibles, los microsatélites, unidades cortas de entre 1 y 6 bp repetidas en tándem, ofrecen apreciables ventajas. Ser una técnica basada en el PCR, necesitar pequeñas cantidades de DNA y su naturaleza codominante, han hecho de ellos una herramienta muy popular en trabajos de investigación en animales y plantas. Pese a la importancia del camote (Ipomoea batatas L.) en el mundo, sólo un pequeño número de marcadores microsatélites están disponibles para este cultivo. Con el objetivo de generar mayor cantidad de microsatélites en el presente trabajo se construyeron dos librerías genómicas utilizando el DNA del cultivar africano “Tanzanía”. La búsqueda se basó en hallar microsatélites trinucleótidos, los cuales cuentan con la particularidad de reducir considerablemente la presencia de “bandas tartamudas” en comparación con los microsatélites dinucleótidos. El enriquecimiento de las librerías genómicas alcanzó el 1.59 % de un total de 2900 colonias evaluadas por diferentes métodos de selección, como White/blue, Colony lift y Southern blot. Quince pares de iniciadores fueron diseñados y ocho de ellos mostraron polimorfismo en un total de once accesiones de camote, provenientes de diversos lugares del mundo, mantenidas en el banco de germoplasma del Centro Internacional de la Papa (CIP). / --- A basic requisite for any breeding program based in marker-assisted selection (MAS) is counting with a suitable number of polymorphic markers. Among the large variety of molecular markers available, microsatellites, short tandem repeat units of between 1 and 6 bp in length, offer appreciable advantages. Being a PCR-based technique, requiring only small amounts of DNA and their co-dominant nature have made them a very popular tool in animal and plant studies. Despite the importance of sweetpotato (Ipomoea batatas L.) in the world, only a small set of microsatellite markers are available for this crop. Aiming to generate a large number of SSR markers in sweetpotato, two genomic libraries have been constructed using DNA of an african sweetpotato cultivar "Tanzania". In order to look for tri-nucleotide microsatellites, which frequently produce fewer “stutter bands” as compared to di-nucleotide microsatellites. The enrichment of genomic libraries achieved 1.59 % of a total number of 2900 clones evaluated by different screening methods as White/blue, Colony lift and Southern blot. Fifteen pair of primers were designed, and eight of them showed polymorphism in eleven sweetpotato accessions from different places of the world, which are kept in the germoplasm bank of the International Potato Center (CIP).

El gorgojo del camote del genero Cylas spp es la mayor plaga del camote (Ipomoea batatas). Su rendimiento puede verse afectado hasta en un 80%. Un rango de estrategias de control esta disponible, entre ellas, la tecnología de los cultivos transgénicos. La transformación del camote con inhibidores de serino proteinasas ofrece una nueva estrategia para desarrollar resistencia contra esta plaga. Estas proteinas se unen a las proteinasas en el intestino medio del insecto interfiriendo con su metabolismo. El espectro de inhibición del inhibidor de tripsina de soja (Glicine max) gen SKTI contra las proteasas del intestino medio del insecto es mayor que los inhibidores endogenos del camote. El uso del promotor del gen de la β-amilasa, del camote (Ipomoea batatas), podría optimizar la expresión del gen inhibidor de tripsina de soja del tipo Kunitz (SKTI) en la raíz reservante del camote, para controlar al gorgojo Cylas spp. Bajo este criterio, en la presente tesis, se describe el diseño dos vectores binarios, designados como pCIP36 y pCIP37, ambos, conteniendo el gen skti-4 (un miembro de la familia de los genes SKTI) controlado por el promotor de la β-amilasa, y también, el empleo de uno de ellos para realizar un ensayo de agro-transformaciónPara construir el vector pCIP36, se procedió a realizar un clonamiento del promotor del gen de la β-amilasa del camote, en un plásmido pequeño, el pPCR-Script, para luego salir de éste, con sitios de restricción convenientes, que nos permitieron ligar el promotor al gen skti-4, el cual fue previamente clonado, en el plásmido binario pMOG800. Para construir el pCIP37, se utilizo el promotor de la β-amilasa obtenido mediante PCR, con iniciadores que nos permitieron incorporar sitios de restricción convenientes, a los extremos del promotor, para luego ligar simultáneamente, este, con el gen skti-4 en el plásmido binario pCAMBIA 1304.Los plásmidos así obtenidos, fueron verificados mediante análisis de restricción. Posteriormente, estos plásmidos, fueron utilizados para transformar cepas de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 y enseguida cepas conteniendo el plásmido pCIP37 fueron utilizadas para agrotransformar camote, para ello, se utilizo como explantes hojas completas, incluyendo el peciolo (de 0.5 a 1 cm de longitud) de plantas in vitro, de 4 semanas, del cultivar Tanzania, obteniéndose posteriormente, callos potencialmente transgénicos, los que fueron evaluados mediante la expresión de los genes reporteros mGFP5 y GUSAsta.

Un requisito básico para cualquier programa de mejoramiento basado en la selección asistida por marcadores (MAS) es contar con un adecuado número de marcadores polimórficos. Entre toda la variedad de marcadores moleculares disponibles, los microsatélites, unidades cortas de entre 1 y 6 bp repetidas en tándem, ofrecen apreciables ventajas. Ser una técnica basada en el PCR, necesitar pequeñas cantidades de DNA y su naturaleza codominante, han hecho de ellos una herramienta muy popular en trabajos de investigación en animales y plantas. Pese a la importancia del camote (Ipomoea batatas L.) en el mundo, sólo un pequeño número de marcadores microsatélites están disponibles para este cultivo. Con el objetivo de generar mayor cantidad de microsatélites en el presente trabajo se construyeron dos librerías genómicas utilizando el DNA del cultivar africano “Tanzanía”. La búsqueda se basó en hallar microsatélites trinucleótidos, los cuales cuentan con la particularidad de reducir considerablemente la presencia de “bandas tartamudas” en comparación con los microsatélites dinucleótidos. El enriquecimiento de las librerías genómicas alcanzó el 1.59 % de un total de 2900 colonias evaluadas por diferentes métodos de selección, como White/blue, Colony lift y Southern blot. Quince pares de iniciadores fueron diseñados y ocho de ellos mostraron polimorfismo en un total de once accesiones de camote, provenientes de diversos lugares del mundo, mantenidas en el banco de germoplasma del Centro Internacional de la Papa (CIP). / A basic requisite for any breeding program based in marker-assisted selection (MAS) is counting with a suitable number of polymorphic markers. Among the large variety of molecular markers available, microsatellites, short tandem repeat units of between 1 and 6 bp in length, offer appreciable advantages. Being a PCR-based technique, requiring only small amounts of DNA and their co-dominant nature have made them a very popular tool in animal and plant studies. Despite the importance of sweetpotato (Ipomoea batatas L.) in the world, only a small set of microsatellite markers are available for this crop. Aiming to generate a large number of SSR markers in sweetpotato, two genomic libraries have been constructed using DNA of an african sweetpotato cultivar "Tanzania". In order to look for tri-nucleotide microsatellites, which frequently produce fewer “stutter bands” as compared to di-nucleotide microsatellites. The enrichment of genomic libraries achieved 1.59 % of a total number of 2900 clones evaluated by different screening methods as White/blue, Colony lift and Southern blot. Fifteen pair of primers were designed, and eight of them showed polymorphism in eleven sweetpotato accessions from different places of the world, which are kept in the germoplasm bank of the International Potato Center (CIP).

En el Perú son varios los potyvirus que se encuentran infectando el camote (Ipomoea batatas), siendo el mas común el Sweet potato feathery mottle(SPFMV). Sin embargo, actualmente no existen datos de secuencia nucleotídica par estos virus. En el presente estudio, se determinaron y analizaron los datos de la secuencia nucleotídica de la región 3’ terminal (~1800 pb) de 17 aislamientos de potyvirus colectados de campos que se encuentran en las seis principales zonas de cultivo de camote en el Perú. Los resultados de la comparación de secuencias y análisis filogenéticos mostraron que tres de las cuatro cepas que son reconocidas dentro del SPFMV, se encuentran en el Perú, incluyendo la cepa Este de Africa. Del mismo modo, se encontraron aislamientos pertenecientes de otros dos potyvirus denominados sweet potato virus G(SPVG) y sweet potato virus 2 (SPV2). Análisis posteriores revelaron que SPFMV, SPVG y SPV2 son virus relacionados y forman una línea filogenética dentro del genero Potyvirus que tienen como hospederos a plantas del genero Ipomoea. El estudio también reporta la ocurrencia de eventos de recombinación entre aislamientos de diferentes cepas de SPFMV. / Several potyviruses are found infecting sweet potato (Ipomoea batatas) in Peru, of which sweet potato feathery mottle virus (SPFMV, genus Potyvirus) is the most common. However, sequence data for these viruses are not available from Peru. In this study, the 3’-terminal ~1,800 nucleotide sequences of 17 potyvirus samples collected from the six main sweet potato-producing areas of Peru were determined and analyzed. Results of sequence comparisons and phylogenetic analysis showed that three of the four recognized SPFMV strain groups, including the East African strain, are established in Peru as well as two other potyviruses: sweet potato virus G (SPVG) and sweet potato virus 2 (SPV2). The analysis further revealed that SPFMV, SPVG and SPV2 are related and form an Ipomoea-specific phylogenetic lineage within the genus Potyvirus and identified for the first time recombination events between viruses from different strain groups of SPFMV. / Tesis

Un índice de genes de camote Ipomoea batatas (L.) Lam. ha sido establecido basado en el pirosecuenciamiento. Dos colecciones normalizadas de cDNA de tallos y hojas de camote cultivar Tanzania que habían sido expuestos a sequía, dieron 524,209 reads. Después del establecimiento de los parámetros óptimos de ensamblaje, estos reads fueron ensamblados junto con 22,094 EST disponibles públicamente en el GenBank, dando como resultado del ensamblaje 31,685 contigs y 34,733 singletons. Las comparaciones usando Blastx en la base de datos del UniRef100 permitió la anotación de 23,957 contigs y 15,342 singletons, resultando en 24,657 genes únicos. Además, 27,119 secuencias no tienen ninguna coincidencia con las secuencias proteicas del Uniref100. La anotación de 24,763 secuencias incluye la atribución de GO terms. Adicionalmente, se han encontrado 293 genes involucrados en la respuesta a estrés hídrico. Basado en este índice de genes, se ha identificado 195 marcadores microsatélites que fueron amplificados exitosamente y evaluados en un grupo de seis hexaploides de Ipomoea batatas y dos diploides de Ipomoea trífida. Palabras claves: anotación de genes, ensamblaje de transcriptoma, Ipomoea batatas, Ipomoea trífida, marcadores microsatélites, pirosecuenciamiento 454, recursos genéticos. / --- A sweetpotato Ipomoea batatas (L.) Lam. gene index was established based on pyrosequencing. Two normalized cDNA collections from stems and leaves were produced from drought stressed sweetpotato cultivar Tanzania and yielded 524,209 pyrosequencing reads. After establishment of the optimal assembly parameters, these reads were assembled together with 22,094 publically available expressed sequence tags into 31,685 sets of overlapping DNA segments and 34,733 unassembled sequences. Blastx comparisons with the UniRef100 database allowed annotation of 23,957 contigs and 15,342 singletons resulting in 24,657 putatively unique genes. Further 27,119 sequences had no match to protein sequences of UniRef100 database. Annotation of 24,763 sequences included the attribution of gene ontology terms to as many sequences as possible. In adition it was found 293 genes involved in water response. Based on this gene index, we have identified 195 gene-based microsatellite markers that could be successfully amplified and scored in a test panel of six hexaploid I. batatas and 2 diploid I. trifida genotypes. Key words: Ipomoea batatas, Ipomoea trífida, gene annotation, genetic resources, microsatellite markers, 454 pyrosequencing, transcriptome assembly.

La transferencia horizontal de genes (HGT) ha sido uno de los temas más debatidos en biología evolutiva durante las últimas dos décadas debido a que esto ha desafiado considerablemente nuestra visión acerca de la historia evolutiva de los genomas. En el caso de organismos procariotas como las bacterias, la adquisición de genes de otros individuos alejados filogenéticamente les ha permitido producir genomas extraordinariamente heterogéneos y dinámicos cambiando por tanto, la ecología y la patogenicidad de las especies bacterianas (Maiden 1998; Gogarten et al., 2002; Ochman et al., 2000). En eucariotas también se ha registrado la ocurrencia de eventos de HGT, los cuales incluyen a un gran número de genes provenientes de varios donadores en los rotíferos de la clase Bdelloidea (Gladyshev et al., 2008) o la transferencia de genes de la bacteria intracelular Wolbachia dentro del genoma de sus hospederos artrópodos (Hotopp et al., 2007). En plantas, el modelo mejor conocido sigue siendo el del género Agrobacterium cuyo mecanismo de infección involucra la transferencia e integración de una región del plásmido Ti al genoma de la célula vegetal. El impacto de este hallazgo ha tenido grandes aplicaciones en diversos campos de la biología vegetal, agricultura y biotecnología. Sin embargo, el descubrimiento de secuencias homólogas al T-DNA del plásmido Ri de Agrobacterium rizhognenes en el genoma de especies del género Nicotiana (White et al., 1983; Furner et al., 1986), Daucus carota “zanahoria” (Spano et al., 1982) y Convulvus arvensis (Tepfer, 1982) han evidenciado que la ocurrencia de este tipo de eventos actúan como una fuerza significativa en la evolución de genomas eucariotas (Richardson y Palmer, 2007; Bock, 2010; Talianova y Janousek, 2011). La importancia de estos hallazgos incrementa la necesidad de realizar más investigaciones para entender el mecanismo de flujo horizontal de genes a través de bacterias en la evolución de plantas superiores, por lo que el presente trabajo de tesis pretende identificar y caracterizar la presencia de secuencias homólogas al T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium spp. en el genoma de Ipomoea batatas (L.) Lam “camote” y especies silvestres relacionadas, con el fin de evidenciar la ocurrencia de eventos de HGT en este género y el posible impacto de este hallazgo en su evolución. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizado por el autor / Realiza eventos transgénicos de los cultivares Imby, CIP440163 y Jonathan de I. batatas con los genes de resistencia cry3Ca1 y cry7Aa1 vía A. tumefaciens. Para ello, se evalúa la sensibilidad de los callos embriogénicos de los tres cultivares de camote al antibiótico kanamicina (agente de selección) y se determina la eficiencia de transformación de callos embriogénicos de los tres cultivares de camote vía A. tumefaciens (portando el plásmido pCIP100) a las 8 semanas. Se observa que la concentración óptima de kanamicina para los tres cultivares fue de 10 mg/l y la eficiencia de transformación de los callos fue de 40,3 %, 22,3 % y 12,6 % en los cultivares Imby, Jonathan y CIP440163, respectivamente. La transformación genética de los embriones somáticos de los tres cultivares de camote vía A. tumefaciens utilizando los genes cry3Ca1 y cry7Aa1 (plásmido pCIP84) y su regeneración vía embriogénesis somática, da como resultado 35 eventos transgénicos del cultivar Imby, 16 del cultivar Jonathan y 4 del cultivar CIP440163, con una eficiencia de transformación de 3,2 %, 2,8 % y 0,4 %, respectivamente. El método de transformación genética por embriogénesis somática fue eficiente en los tres cultivares evaluados y la relación entre sus eficiencias de transformación se mantuvo, aunque se usaron diferentes construcciones genéticas (plásmido pCIP100 y pCIP84). / Tesis