Orientador: Octavio Henrique de Oliveira Pavan / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-15T10:37:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cavallaro_AngelaCristina_M.pdf: 1926502 bytes, checksum: 187a7aee90427f890120838056b65bb0 (MD5) Previous issue date: 1988 / Resumo: Este trabalho objetivou a padronização de técnicas visando a caracterlzação de proteínas do Vírus de Granulose de Diatraea saccharalis (VGDs). Várias metodologias de purificação foram testadas para oVGDs, até a definição do padrão ideal a ser seguido, para se obter o vírus livre de contaminantes. Algumas variações experimentadas mostraram-se ineficientes, pois não oi obtido o vírus puro. A purificação do VGDs através de centrifugação diferencial apresentou, como contaminantes, restos de tecidos e células de lagartas e, algumas vezes, bactérias.O emprego de triton X-100, como detergente, fez com que a cápsula protéica do VGDs se solubiliasse durante os passos de sua purificação. O esquema de purificação que se mostrou mais eficiente foi aquele em que o macerado de lagartas passou por um ciclo de centrifugação diferencial, seguida de centrifugação em colchão e gradiente de sacarose e, neste último, coletando-se a banda mais próxima à concentração de 58 %. A observação das amostras de VGDs em microscópio eletrônico mostrou que estas, quando ressuspendidas em tampão Tris-HCI 0,1 M pH 7,8, apresentavam as partículas virais agregadas, e separadas e nítidas quando ressuspendidas em água destilada. O emprego de soluções alcalinas na solubilização da cápsula protéica do VGDs não apresentou o resultado esperado, ou seja, a obtenção da granulina. Mesmo variando-se o tempo e a temperatura de lncubação das amostras, a concentração de proteínas apresentou-se sempre muito baixa.A solubilização do VGDs com TCA apresentou uma concentração de proteínas maior, possibilitando o reconhecimento da granulina, quando as amostras foram corridas em eletroforese. Foi testada a solubilização com TCA em vírus que já tinham o peso molecular de suas respectivas proteínas da matriz conhecido através de solubilização alcalina (VPNAc, VPNAg, VPNHz e VPNTn). Houve uma pequena variação que não pode ser atribuída ao método de obtenção destas, e sim à variabilidade de metodologias empregadas em eletroforese. Dessa forma, pode-se concluir que com o emprego de TCA é possível obter-se as proteínas do vírus e também determinar o seus pesos moleculares. Em relação à metodologia de eletroforese, a que mostrou melhor resolução foi a de poliacrilamida e SDS sem o emprego de uréia. Através da análise de padrões eletroforéticos pode-se obter um padrão das proteínas do VGDs apresentando a granulina como principal componente com um peso molecular de 31500 d / Abstract: This study aimed a padronization of methodology envisaging the characterization of the proteins of the Diatrea saccharalis Granulosis Vírus (DsGV). Several methodologies for the purification of DeGV were tested, to obtain vírus free of contaminants. Some variations in the protocol experimented were not efficient resulting in contaminated preparatlons. The purification of DsGV through differential centrifugation showed tissue and cells debris and bacteria as contaminants. The use of triton X-100 as detergent solubilized the proteic capsule of DsGV during the purification steps. The most effective metodologiy for purification was the homogenization of larvae followed by a cicle of differential centrifugation and by centrifugation in a sucrose cushion and gradient. The vírus band is found at the sucrose concentration of 58 %. The observation of the DsGV samples in eletron microscope showed that the samples in Tris-HCI buffers formed bundles wich were not formed when the samples where mantained in water. The use of alkaline solutions to dissolve the proteic capsule of DsGV did not presented the expected results in different Incubation times and temperatures resulting in all cases in lows concentration of the proteins. Better results were obtained with TCA which results in much higher yelds of total protein. To evaluate the method, a series of other baculoviruses were treated with TCA and the resulting protein profiles compared to those obtained by other authors using the alkaline treatment. The results were very similar showing that the method is a viable alternative procedure. The electrophoresis metodology showing the best resolution of the proteins was that with polyacrilamide and SDS without urea. The eletrophoretic profile of DsGV proteins has been obtained and the main component can be identifired as granulin having a molecular weight of 31500 d / Mestrado / Genetica / Mestre em Biologia

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2012. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-07-04T23:59:50Z No. of bitstreams: 1 2012_CristinaLimadeMacedo.pdf: 1092613 bytes, checksum: d4d04d70cd2cf8f4d1fa3dec41b22ff7 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-05T17:53:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_CristinaLimadeMacedo.pdf: 1092613 bytes, checksum: d4d04d70cd2cf8f4d1fa3dec41b22ff7 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-05T17:53:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_CristinaLimadeMacedo.pdf: 1092613 bytes, checksum: d4d04d70cd2cf8f4d1fa3dec41b22ff7 (MD5) / Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794; Lepidoptera: Crambidae) é responsável por perdas econômicas nas lavouras afetando a cultura e o aproveitamento industrial da cana-de-açúcar. Seu hábito alimentar gera dificuldade no seu controle causando impactos à cultura canavieira. O desenvolvimento de novas estratégias para o seu controle de extrema importância. Uma alternativa para o controle desses insetos é a utilização de agentes de controle biológico, como Bacillus thuringiensis (Bt), pois esta bactéria sintetiza diferentes proteínas tóxicas a muitas pragas. Este estudo teve como objetivo, selecionar 106 estirpes da coleção de Bactérias de Invertebrados da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia tóxicas à broca-da-cana. As estirpes selecionadas foram caracterizadas por métodos bioquímicos, moleculares e a ligação das toxinas aos receptores presentes no intestino médio das larvas de D. saccharalis foi analisada. Foram selecionadas três estirpes de B. thuringiensis, denominadas S602, S1264 e S1301, que apresentaram atividade contra D. saccharalis. A caracterização do perfil protéico revelou a presença de proteínas de 130 e 65 kDa, que correspondem às toxinas Cry1 e Cry2, respectivamente. A caracterização molecular mostrou a existência dos genes cry1 e cry2, corroborando com os resultados mostrados no perfil protéico. As proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry2Aa expressas individualmente por estirpes de Bt foram purificadas, solubilizadas, ativadas com tripsina e biotiniladas para a realização de ensaios de ligação para a observação da ligação da proteína à microvilosidades do intestino do inseto. A CL50 das proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2Aa variou entre 222 e 610 ng/cm2. As mesmas apresentaram resultados de toxicidade significativamente semelhantes. As estirpes tóxicas selecionadas neste trabalho e o padrão apresentaram CL50 entre 8 e 43 ng/cm2 bastante inferior e significativamente diferente do das toxinas puras, indicando haver sinergismo entre as toxinas. Os resultados dos ensaios de ligação aos receptores de membrana intestinais mostraram, pela primeira vez, as interações existentes entre as toxinas e os receptores, confirmando o potencial tóxico destas proteínas à D. saccharalis. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794; Lepidoptera: Crambidae) is responsible for great economic losses in crops affecting the culture and the industrial utilization of sugarcane. There eating habits make harder the control by conventional tools causing impacts to sugarcane crops. The development of new strategies for its control is extremely important. An alternative for the control of this insects is the use of biological control agents such as Bacillus thuringiensis (Bt), based on the action of many different proteins synthesized by the bacteria which are active against insects orders. This study aimed to selective strains from collection of Bt in Embrapa Genetic Resources and Biotechnology toxic to the sugarcane borer, D. saccharalis. The strains selected were characterized by biochemical and molecular methods, and the binding assays of the toxins to midgut cell receptors of D. saccharalis were analysed. We selected three strains of B. thuringiensis, named S602, S1264 and S1301, which showed activity against D. saccharalis. Characterization of protein profiles revealed the presence of proteins of 130 and 65 kDa, corresponding to toxins Cry1 and Cry2, respectively. The molecular characterization showed the presence of cry1 and cry2 genes, confirming the results shown in the protein profile. Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac and Cry2Aa proteins were expressed individually by strains of Bt. The proteins were purified, solubilized, biotinylated and activated with trypsin for performing binding assays for the observation of protein binding to the microvilli of the insect gut. The CL50 of the proteins Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac and Cry2Aa showed variation between 222 and 610 ng/cm2. They have presented in the dose bioassay (LC50) Cry toxins showed no significant differences toxic results. The toxic strains selected at this work and standard showed LC50 between 8 and 43 ng/cm2 values inferior and significant different to the pure toxins, showed existence of synergism between toxins. The results of binding assays done with BBMV’s (Brush-Border Membrane Vesicle) of D. saccharalis, showed for the first time, the interactions between receptors and toxins, confirming the potential toxic effects of these proteins to D. saccharalis.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-01T11:34:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 797009 bytes, checksum: 3153b0fa04e3d214b8abfb76f1716020 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-01T11:34:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 797009 bytes, checksum: 3153b0fa04e3d214b8abfb76f1716020 (MD5) Previous issue date: 2014-07-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A broca-da-cana Diatraea saccharalis Fab. (Lepidoptera: Crambidae) é a principal praga da cana-de-açúcar no Brasil. No entanto, apesar da importância dessa praga, não há métodos precisos para comparação da resistência de genótipos e seleção de genótipos resistentes a serem aplicado por programas de melhoramento genético de cana-de-açúcar. Esse estudo foi conduzido para determinar um método para comparar injúria causada por broca-da-cana no colmo de genótipos de cana-de-açúcar em casa-de- vegetação, investigar características de resistência presentes na folha, superfície e interior do colmo de seis genótipos de cana-de-açúcar e a relação entre esses fatores de resistência. Adicionalmente, foi feito um estudo sobre divergência genética de genótipos de cana-de-açúcar para resistência à broca-da-cana através do uso de análises de agrupamento. A infestação de plantas individuais (não em touceiras) com sete meses de idade com 20 lagartas (3o ou 4o instar) por planta para avaliação do comprimento de galerias foi adequada para comparar a injúria entre genótipos. Os genótipos SP803280, RB928064 e RB835486 apresentaram as menores injúrias no colmo enquanto o genótipo SP891115 apresentou a maior injúria. As lagartas gastaram mais tempo para penetrar nos colmos do genótipo SP803280 em relação ao genótipo SP891115, indicando que esse genótipo apresenta alguma característica na superfície do colmo que atrasa a entrada da lagarta. As lagartas nos últimos instares apresentaram o menor ganho de massa ao se alimentarem no interior do colmo do genótipo SP813250, indicando que esse genótipo apresenta algum fator de resistência afetando o desenvolvimento da larva dentro do colmo. As análises de correlação entre os fatores de resistência indicam que o tempo gasto pelas lagartas para entrar no colmo das plantas está mais diretamente relacionado com a injúria no colmo do que a alimentação das lagartas no interior do colmo. Os genótipos RB867515 e SP891115 causaram a mais alta mortalidade de lagartas novas durante o período em que se alimentam na folha, indicando que a presença de fatores de antibiose na folha desses genótipos. As análises de agrupamento dividiram os genótipos em três grupos indicando divergência genética entre os genótipos. / The sugarcane stalk borer Diatraea saccharalis Fab. (Lepidoptera: Crambidae) is the most important pest of sugarcane in Brazil. However, despite the importance of this pest, there is a lack of efficient methods to compare the resistance of genotypes and select resistant sugarcane genotypes to be employed by sugarcane breeding programs. This study was conducted to determine a greenhouse method to compare stalk damage among sugarcane genotypes, investigate resistance factors present in the leaves, stalk surface and within the stalks of six Brazilian sugarcane cultivars and the relationship among these resistance factors. In addition, we assessed the genetic divergence of sugarcane genotypes to borer resistance by using cluster analysis. The infestation of 7- month-old single plants with 20 larvae (3rd - 4th instar) per plant for assessment of tunnel length was proved adequate to compare stalk damage among sugarcane genotypes. The genotypes SP803280, RB928064 and RB835486 had the lowest stalk damage while SP891115 had the highest damage. The larvae spent more time to enter the stalk of the genotype SP803280 compared to SP891115, indicating that this genotype has some resistance trait in stalk surface delaying the larvae entrance in the stalk. Late-stages larvae feeding in the stalk of SP813250 had the lowest weight gain indicating that this genotype present some resistance factor affecting larval development within the stalks. Correlation analysis among resistance factors indicated that the time spent by larvae to enter the stalk is more related to stalk damage than the larval feeding within the stalks. The genotypes RB867515 and SP891115 caused the highest mortality of early-stage larvae feeding on the leaves, which indicate the presence of antibiotic factors in the leaves of these genotypes. Cluster analysis divided the genotypes in three groups, indicating the genetic dissimilarity between genotypes. The results from this study may contribute in selection of resistant clones and choice of genitors for crossings in sugarcane breeding programs.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Química e Biológica, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-10T20:31:43Z No. of bitstreams: 1 2018_DanielDavidNoriegaVásquez.pdf: 3129944 bytes, checksum: 6cdc13424d333feff42c269e22257479 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-14T18:54:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_DanielDavidNoriegaVásquez.pdf: 3129944 bytes, checksum: 6cdc13424d333feff42c269e22257479 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-14T18:54:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_DanielDavidNoriegaVásquez.pdf: 3129944 bytes, checksum: 6cdc13424d333feff42c269e22257479 (MD5) Previous issue date: 2018-07-10 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / A cana-de-açúcar é uma das culturas mais importantes no Brasil para a produção tanto de açúcar quanto de etanol de segunda geração. Os ataques dos insetos-praga, broca-da-cana (Diatraea Saccharalis, Fabricius 1770) e broca-gigante da cana (Telchin licus licus, Drury 1770), reduzem a produtividade nas lavouras gerando perdas de milhões de dólares por ano para a indústria canavieira no país. Os métodos de controle utilizados atualmente têm se mostrado insuficientes para evitar os prejuízos produzidos por essas pragas. A ferramenta de RNA interferente (RNAi) considera-se promissora para o controle de insetos-praga, isto, mediante a utilização de moléculas de RNA dupla fita (dsRNA) para silenciar genes essenciais para a sobrevivência do inseto. No presente trabalho, foi determinado o transcritoma das pragas da cana-de-açúcar mencionadas, visando a identificação de genes potenciais para silenciamento e validação de moléculas de dsRNA para o controle desses insetos. A partir do sequenciamento (RNA-seq) e análise in silico do transcritoma do intestino médio de larvas tratadas com diferentes dietas (cana-de-açúcar e dieta artificial), foram gerados bancos de dados com um total de 49.225 e 53.108 contigs dentre os quais 1.872 e 2.465 foram diferencialmente expressos (EdgeR), para D. saccharalis e T. l. licus, respectivamente. A análise de enriquecimento por ontologia genica (GO) permitiu a identificação de genes que estão envolvidos, principalmente, com as vias de detoxificação, de transporte de moléculas, de digestão e de regulação hormonal. Para validação das moléculas de dsRNA, foram selecionadas as sequências dos genes que codificam a esterase do hormônio juvenil (JHE). Essa enzima regula os processos de muda e metamorfose do inseto por meio da degradação controlada do hormônio juvenil. O silenciamento do gene jhe utilizando uma concentração de dsRNA de 10μg/cm3 de dieta não apresentou mortalidade em larvas de D. saccharalis, mas apresentou mortalidade de até 60% em larvas de penúltimo ínstar de broca-gigante. O presente estudo é de grande relevância, uma vez que foi possível identificar pela primeira vez a resposta de RNAi para T. l. licus e mostrar a eficiência das moléculas de dsRNA desenhadas, para o controle deste inseto praga. Finalmente, cabe destacar que os dados gerados poderão ser usados em futuros estudos para desenhar novas moléculas de dsRNA potenciais para o controle da broca da cana e da broca-gigante. / Sugarcane is one of the most important crops in Brazil, utilized for sugar and second-generation biofuel production. Damage caused by the pests, sugarcane borer (Diatraea Saccharalis, Fabricius 1770) and sugarcane giant borer (Telchin licus licus, Drury 1770), reduces crop yield that cause millions of dollars loss annually to the sugarcane industry. Currently used pest management approaches have failed to reduce the damages caused to sugarcane crops. RNA interference (RNAi) is an alternative biotechnological tool for pest management, that uses double-stranded RNA molecules (dsRNA) to knock-down essential genes required for the insect survival. In this work, transcriptomes from sugarcane borer and sugarcane giant borer were obtained, for the identification of target genes for RNAi and further validation of dsRNA molecules. Sequencing (RNA-seq) and in silico analysis of midgut transcriptome obtained from larvae treated on different diets (Sugarcane and artificial diet), generated a transcript database containing 49.225 and 53.108 contigs, amongst which 1.872 and 2.465 were differentially expressed (EdgeR), for D. saccharalis and T. l. licus, respectively. GO Enrichment analysis allowed identification of genes involved, mainly with detoxification pathways, molecular transport, digestion and hormonal regulation. In order to validate dsRNA molecules via oral delivery, gene sequences coding for juvenile hormones esterase (JHE) were selected. This enzyme regulates molting and metamorphosis process in insects, by controlled degradation of juvenile hormone (JH). Knock-down of JHE gene, using a 10 μg dosage of dsRNA, did not result in lethal effects for D. saccharalis larvae. Nevertheless, the same amount of dsRNA was lethal for penultimate instar of sugarcane giant borer larvae, achieving approximately 60% mortality rate. The current work is very significant, since it’s the first report of RNAi characterization in T. l. licus that show efficiency of specific dsRNA molecules reducing survival of this insect pest. Furthermore, the data generated here can also be used for validation of other potential dsRNA molecules for D. saccharalis and T. l. licus management.