Parmi les différents types de canaux ioniques, les canaux potassium (K+) sont très largement exprimés au niveau des cellules eucaryotes. Ils se répartissent en plusieurs familles et sous-familles. Parmi celles-ci, les canaux K+ ATP-dépendants (KATP) représentent une classe tout à fait particulière. En effet, ils ont la particularité d’être sensibles à la concentration cytosolique d’ATP et permettent ainsi de coupler le potentiel membranaire de la cellule à son statut métabolique. Le canal KATP est un complexe hétéro-octamérique constitué de 2 sous-unités : une sous-unité Kir6.x (Kir6.1 ou Kir6.2) formant le pore du canal et appartenant à la famille des canaux potassiques de type « inward rectifier », et une sous-unité régulatrice SURx (SUR 1 ou SUR2A/B) faisant partie des protéines ABC (ATP-binding cassette). L’expression hétérologue des sous-unités Kir6.x et SURx suivant différentes combinaisons conduit à la formation de plusieurs types de canaux KATP possédant des propriétés électro-physiologiques et des sensibilités aux nucléotides et aux agents pharmacologiques distinctes. Les canaux KATP ont, à ce jour, été très peu étudiés dans la fonction de reproduction. Au cours de ce travail, nous avons notamment caractérisé la répartition tissulaire des différentes sous-unités Kir6.x et SURx constitutives des canaux KATP dans les différents segments de l’appareil reproducteur du rongeur mâle. Des marquages immuno-histochimiques ont permis de détecter les sous-unités Kir6.2 et SUR2 au niveau du testicule, de l’épididyme et du canal déférent. Au niveau du testicule, ces marquages sont localisés dans les cellules de Sertoli, ainsi que dans les spermatides et les spermatozoïdes présents au centre du tube séminifère. Les cellules de l’épithelium épididymaire sont également marquées ainsi que les spermatozoïdes présents dans la lumière. De plus, le marquage Kir6.2 et SUR2 est présent dans l’épithélium du canal déférent et se retrouve au niveau de l’épithélium de plusieurs glandes annexes (prostate, vésicule séminale, glande de coagulation). Aucun marquage n’est détecté pour les sous-unités Kir6.1 et SUR1. Une étude plus détaillée des marquages observés au niveau de l’épithélium épididymaire révèle une colocalisation des sous-unités Kir6.2 et SUR2 dans les cellules principales de l’épithélium épididymaire avec un marquage particulièrement intense au niveau de l’appareil de Golgi. La présence de ces deux sous-unités au sein de l’épididyme a été confirmée par immunoblots. La présence d’ARNm codant pour Kir6.2 et SUR2 a été détectée par RT-PCR à partir d’extraits d’ARN d’épididymes adultes et pré-pubères de souris. Nous avons également démontré, par immunofluorescence indirecte, une association Kir6.2 / SUR2 dans des échantillons d’épididymes humains, bovins, canins et félins. Les marquages ont été répétés sur des étalements de spermatozoïdes provenant de rongeurs mais aussi d’autres espèces (humains, canins et équins). Les sous-unités Kir6.2, SUR2 mais également Kir6.1 ont été observées. Leur présence a été confirmée par immunoblotting. L’ARNm codant pour ces différentes sous-unités, mais pas pour la sous-unité SUR1, a été détecté par RT-PCR. Nous avons tenté ensuite de mieux cerner le rôle physiologique potentiel des canaux KATP au niveau des spermatozoïdes de souris. Comme les canaux KATP participent indirectement au contrôle de l’activité des canaux calciques potentiel-dépendants et à l’influx de calcium, nous avons mesuré la concentration de calcium intracellulaire de spermatozoïdes isolés et incubés dans différentes conditions expérimentales. Nous avons pu démontrer que différents agents pharmacologiques connus pour inhiber l’activité des canaux KATP étaient susceptibles de provoquer une augmentation rapide et soutenue de la concentration cytosolique en Ca2+ libre de spermatozoïdes isolés et périfusés. L’absence de calcium extracellulaire abolit l’effet des inhibiteurs des canaux KATP, ce qui confirme le rôle de ces canaux ioniques dans le contrôle de l’influx de calcium au niveau des spermatozoïdes. Nous avons ensuite évalué l’implication des canaux KATP dans la réaction acrosomiale, processus physiologique calcium-dépendant indispensable à la fécondation de l’ovocyte. Pour ce faire, nous avons initialement validé une technique de détection et de quantification de la réaction acrosomiale pour le spermatozoïde de souris. Tous les agents pharmacologiques que nous avions précédemment testés et qui augmentaient la concentration cytosolique en Ca2+ libre, induisent également une réaction acrosomiale. Dans le but de mieux cerner le rôle que pourraient jouer les canaux KATP dans les phénomènes sécrétoires participant à la fonction de reproduction, nous nous sommes intéressés au placenta humain dont le processus hormonal sécrétoire (hCG et hPL) est un processus Ca2+-dépendant bien caractérisé. Nous avons mis en évidence, par immunohistochimie, la présence des sous-unités Kir6.2 et SUR2 dans le syncytiotrophoblaste de placentas humains à terme. La présence de ces deux sous-unités a été confirmée par immunoblots et RT-PCR. La sécrétion d’hCG et d’HPL a été étudiée en réponse à divers agents pharmacologiques modulant l’activité des canaux KATP. Dans un modèle expérimental d’explants placentaires incubés, l’addition d’inhibiteurs et/ou d’activateurs des canaux KATP n’affecte pas, de manière significative, la sécrétion d’hCG et d’hPL. En conclusion, nos travaux démontrent, pour la première fois, l’existence de différentes sous-unités formant les canaux KATP au niveau de plusieurs structures de l’appareil reproducteur. Dans le cas des spermatozoïdes, ces canaux semblent être fonctionnels et sont impliqués dans le contrôle de l’entrée de calcium.

Les canaux potassiques sensibles à l’ATP (KATP) sont des canaux omniprésents liant excitabilité et énergie cellulaire. Ils fonctionnent en captant le niveau relatif des nucléotides ATP et ADP à l’intérieur des cellules: Les premiers bloquant le canal et les derniers l’activant. De plus le phospholipide phosphatidylinositol4,5-bisphosphate (PIP2) est connu pour être un puissant régulateur des canaux KATP. Ceux-ci sont présents dans la plupart des tissus excitables et sont impliqués dans un grand nombre de fonctions physiologiques. L’objectif de ma thèse consiste à désigner un bloc dépendant de la lumière au niveau de ces KATP, afin de contrôler son activité optiquement tout en gardant ses propriétés natives. Cela a été accompli par la mutation de différents résidus en cystéine. Ce canal KATP complètement dépendant de la lumière, pourrait être utilisé pour réguler les actions de potentiels via la lumière afin de piloter différents aspects d’électrophysiologie cellulaire mais aussi de développer des applications de photo-traitements.J’ai également réalisé la cartographie fonctionnelle des résidus impliqués dans le gating du canal Kir6.2 sous le contrôle de protéines membranaires interagissant avec le domaine N-terminal. Cela a été réalisé par le design d’un canal artificiel Kir6.2 formé par la fusion du C-terminal d’un RCPG avec le N-terminal du canal. Des structures cristallographiques et des caractérisations fonctionnelles des canaux potassiques ont permis de mettre en évidence la présence de deux portes dans les domaines transmembranaires : le filtre de sélectivité et le « gate A » à l’interface cytoplasmique, et le troisième « gate » dans le domaine cytoplasmique du canal Kir connu sous le nom de « G loop gate ». Enfin j’ai caractérisé de mutations dans le gène ABCC9 codant pour SUR2A et associé au syndrome de Cantu (CS). Ces mutations sont localisées dans le domaine transmembranaire 0 (TMD0) de SUR2A, un domaine essentiel dans l’interaction entre Kir6.2 et SUR dans le complexe KATP. Les résultats suggèrent que les deux mutations cause une hyperactivité du canal via 2 mécanismes distincts : (1) Une diminution de la sensibilité de l’ATP affectant la modulation du PIP2, mais qui n’affecte pas l’activation par le Mg-ADP ou (2) aucun effets en réponse à l’ATP ou Mg-ADP, mais une sensibilité accrue au PIP2. Ces découvertes soulignent le rôle essentiel du TMD0 dans la modulation du « gating » de Kir6.2. En particulier, cela démontre qu’il y a un contrôle de la réponse du canal par des effecteurs intracellulaires qui se fixent sur Kir6.2, impliquant des interactions très liées entre Kir6.2 et la région TMD0. / ATP-sensitive K+ (KATP) channels are ubiquitous channels designed to couple excitability to cellular energy. They perform this function by sensing the relative levels of the intracellular nucleotides ATP and ADP; with ATP blocking the channel and ADP activating it. Additionally, the phospholipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) is known to be a strong regulator of KATP channels. These channels are present in many excitable tissues and involved in many physiological functions. The aim of this thesis is to design a light dependent block of the KATP channel, in order to control its activity and have it under optical control while at the same time retaining its native properties. This was accomplished by mutating specific residues to cysteines. This light dependent blocked KATP channel, could be used to regulate action potentials with light to tune diverse aspects of cellular electrophysiology and potentially photo-pharmacology treatment. We also performed a functional mapping of the Kir6.2 channel gate(s) under the control of membrane proteins interacting with the N-terminal domain. This was performed by using a unique artificial gate Kir6.2 channel formed by fusing a GPCR C-terminus to the Kir6.2 N terminus. Crystallographic structures and functional characterizations of potassium channels demonstrated the presence of two gates in the transmembrane domains: the selectivity filter and the "A" gate at the cytoplasmic interface, and a third gate in the cytoplasmic domain of Kir channels known as the G loop gate. Unexpectedly, our results demonstrated that several gates could be involved suggesting a concerted mechanism. Finally, we characterized two single-point mutations in the ABCC9 gene encoding SUR2, that are associated with Cantu syndrome (CS). These mutations are localized in transmembrane domain 0 (TMD0) of SUR2A, an essential domain which mediates the interaction between Kir6.2 and SUR within the K-ATP channel complex. Results suggest that the two mutations cause KATP channel hyperactivity through two divergent mechanisms: (1) a decreased sensitivity to ATP inhibition and affecting the modulation by PIP2, and that does not affect activation by Mg-ADP or (2) any effect on the response to ATP and Mg-ADP, but more sensitive to activation by PIP2. These discoveries underline the essential role of TMD0 in the gating modulation of Kir6.2. They demonstrate in particular that it can control the response of the channel to intracellular effectors that bind to Kir6.2, implying tight interactions between Kir6.2 and the TMD0 region.

La pathologie de la fibrose kystique (FK) est causée par des mutations du gène codant pour le canal Cl- CFTR. Au niveau respiratoire, cette dysfonction du transport transépithélial de Cl- occasionne une altération de la composition et du volume du liquide de surface des voies aériennes. Une accumulation de mucus déshydraté favorise alors la colonisation bactérienne et une réponse inflammatoire chronique, entraînant des lésions épithéliales sévères au niveau des voies aériennes et des alvéoles pouvant culminer en défaillance respiratoire. Le principal objectif de mon projet de maîtrise était d’étudier les processus de réparation de l’épithélium alvéolaire sain, l’épithélium bronchique sain et FK à l’aide d’un modèle in vitro de plaies mécaniques. Nos résultats démontrent la présence d’une boucle autocrine EGF/EGFR contrôlant les processus de migration cellulaire et de réparation des lésions mécaniques. D’autre part, nos expériences montrent que l’EGF stimule l’activité et l’expression des canaux K+ KATP, KvLQT1 et KCa3.1 des cellules épithéliales respiratoires. L’activation de ces canaux est cruciale pour les processus de réparation puisque la majeure partie de la réparation stimulée à l’EGF est abolie en présence d’inhibiteurs de ces canaux. Nous avons également observé que les cellules FK présentent un délai de réparation, probablement causé par un défaut de la réponse EGF/EGFR et une activité/expression réduite des canaux K+. Nos résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes de régulation des processus de réparation de l’épithélium sain et FK. De plus, ils ouvrent de nouvelles options thérapeutiques visant à promouvoir, à l’aide d’activateurs de canaux K+ et de facteurs de croissance, la régénération de l’épithélium respiratoire chez les patients atteints de FK. / The cystic fibrosis pathology (CF) is caused by mutations of the gene coding for the Cl- channel, CFTR. In the lungs, the dysfunction of transepithelial ion transport leads to an alteration of airway surface liquid volume and composition. Dehydrated mucus accumulation then favors chronic bacterial colonisation and inflammatory response, inducing severe epithelial injuries in the airways and the alveoli and then, respiratory failure. The main objective of my master degree project was to study normal alveolar, normal and CF bronchial epithelia repair processes using an in vitro model of mechanical wound-healing. Our results reveal the presence of an EGF/EGFR autocrine loop that controls cell migration and wound-healing. Our results show also that EGF signaling stimulate KATP, KvLQT1 and KCa3.1 K+ channel activity and expression in epithelial cells. K+ channel activation is crucial for repair processes since K+ channel inhibitors prevent most of EGF-stimulated wound-healing. We also observed that CF cells present delayed repair processes, probably caused by an EGF signaling defect and reduced K+ channel activity and expression. Our results allow us to better understand the regulatory mechanisms of normal and CF epithelial repair processes. Futhermore, our results open to new therapeutic options that promote, with K+ channel activators and growth factors, respiratory epithelium regeneration in CF patients.

La pathologie de la fibrose kystique (FK) est causée par des mutations du gène codant pour le canal Cl- CFTR. Au niveau respiratoire, cette dysfonction du transport transépithélial de Cl- occasionne une altération de la composition et du volume du liquide de surface des voies aériennes. Une accumulation de mucus déshydraté favorise alors la colonisation bactérienne et une réponse inflammatoire chronique, entraînant des lésions épithéliales sévères au niveau des voies aériennes et des alvéoles pouvant culminer en défaillance respiratoire. Le principal objectif de mon projet de maîtrise était d’étudier les processus de réparation de l’épithélium alvéolaire sain, l’épithélium bronchique sain et FK à l’aide d’un modèle in vitro de plaies mécaniques. Nos résultats démontrent la présence d’une boucle autocrine EGF/EGFR contrôlant les processus de migration cellulaire et de réparation des lésions mécaniques. D’autre part, nos expériences montrent que l’EGF stimule l’activité et l’expression des canaux K+ KATP, KvLQT1 et KCa3.1 des cellules épithéliales respiratoires. L’activation de ces canaux est cruciale pour les processus de réparation puisque la majeure partie de la réparation stimulée à l’EGF est abolie en présence d’inhibiteurs de ces canaux. Nous avons également observé que les cellules FK présentent un délai de réparation, probablement causé par un défaut de la réponse EGF/EGFR et une activité/expression réduite des canaux K+. Nos résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes de régulation des processus de réparation de l’épithélium sain et FK. De plus, ils ouvrent de nouvelles options thérapeutiques visant à promouvoir, à l’aide d’activateurs de canaux K+ et de facteurs de croissance, la régénération de l’épithélium respiratoire chez les patients atteints de FK. / The cystic fibrosis pathology (CF) is caused by mutations of the gene coding for the Cl- channel, CFTR. In the lungs, the dysfunction of transepithelial ion transport leads to an alteration of airway surface liquid volume and composition. Dehydrated mucus accumulation then favors chronic bacterial colonisation and inflammatory response, inducing severe epithelial injuries in the airways and the alveoli and then, respiratory failure. The main objective of my master degree project was to study normal alveolar, normal and CF bronchial epithelia repair processes using an in vitro model of mechanical wound-healing. Our results reveal the presence of an EGF/EGFR autocrine loop that controls cell migration and wound-healing. Our results show also that EGF signaling stimulate KATP, KvLQT1 and KCa3.1 K+ channel activity and expression in epithelial cells. K+ channel activation is crucial for repair processes since K+ channel inhibitors prevent most of EGF-stimulated wound-healing. We also observed that CF cells present delayed repair processes, probably caused by an EGF signaling defect and reduced K+ channel activity and expression. Our results allow us to better understand the regulatory mechanisms of normal and CF epithelial repair processes. Futhermore, our results open to new therapeutic options that promote, with K+ channel activators and growth factors, respiratory epithelium regeneration in CF patients.

Parmi les différents types de canaux ioniques, les canaux potassium (K+) sont très largement exprimés au niveau des cellules eucaryotes. Ils se répartissent en plusieurs familles et sous-familles. Parmi celles-ci, les canaux K+ ATP-dépendants (KATP) représentent une classe tout à fait particulière. En effet, ils ont la particularité d’être sensibles à la concentration cytosolique d’ATP et permettent ainsi de coupler le potentiel membranaire de la cellule à son statut métabolique.<p>Le canal KATP est un complexe hétéro-octamérique constitué de 2 sous-unités :une sous-unité Kir6.x (Kir6.1 ou Kir6.2) formant le pore du canal et appartenant à la famille des canaux potassiques de type « inward rectifier », et une sous-unité régulatrice SURx (SUR 1 ou SUR2A/B) faisant partie des protéines ABC (ATP-binding cassette). L’expression hétérologue des sous-unités Kir6.x et SURx suivant différentes combinaisons conduit à la formation de plusieurs types de canaux KATP possédant des propriétés électro-physiologiques et des sensibilités aux nucléotides et aux agents pharmacologiques distinctes. \ / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished