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Nenhuma / O efeito bystander induzido por radiação ionizante designa uma série de respostas tais como: trocas entre cromátides irmãs, aberrações cromossômicas, apoptose, formação de micronúcleos, transformação, mutação e instabilidade gênica que ocorrem em células não irradiadas em consequência da exposição de outras células à radiação. O efeito bystander ocorre por meio de dois mecanismos distintos: gapjunctions ou junções gap e fatores sinalizadores secretados no meio de cultura pelas células irradiadas, e posteriormente, recolhidos pelas células não irradiadas. Conhece-se até o momento duas maneiras de se identificar o efeito bystander: através da transferência do meio de cultura de células irradiadas para células não irradiadas e utilizando um micro-feixe de partículas alfa, com o qual se tem absoluto controle em relação à célula ou à organela que recebeu a radiação. Neste trabalho os experimentos foram realizados através da troca do meio de cultura, utilizando-se a princípio quatro linhagens celulares: duas comerciais, a MDA-MB-231, de câncer de mama e a HEK-293 derivada de células de rim embrionário humano e duas estabelecidas por pesquisadores da UFMG, a MGSO-3 e a MACL-1, ambas de câncer de mama. No presente estudo demonstrou-se a ocorrência do efeito bystander através de análise de morte celular por apoptose nas quatro linhagens com variações de densidade. Optou-se por dar maior importância às novas linhagens estabelecidas, pelo fato delas não terem sido ainda investigadas em relação à ocorrência ou não de efeito bystander. Confirmou-se neste trabalho que para as novas linhagens, o efeito bystander varia em relação às doses de radiação, à densidade celular e o tempo em que células não irradiadas ficam em contato com o meio irrad / The bystander effect induced by ionizing radiation refers to a series of responses such as sister chromatid exchanges, chromosomal aberrations, apoptosis, micronuclei formation, transformation, mutation and genetic instability that occur in non-irradiated cells as a result of exposure from other cells to radiation. The bystander effect occurs through two distinct mechanisms: gap-junctions and signaling factors secreted into the culture medium from irradiated cells, and collected by non-irradiated cells. Nowadays two ways to identify the bystander effect are known: through medium transfer from irradiated cells to non-irradiated cells and using an alpha particle microbeam facility, which has total control over the cells or the organelles that receive radiation. In this study, experiments were performed by replacing the culture medium, using four cell lines: two commercial, MDA-MB-231, of breast cancer and HEK-293 derived from human embryonic kidney cells and two established by researchers from UFMG, the MACL-1 and MGSO-3, both from breast cancer. In the present study the occurrence of bystander effect was demonstrated by apoptotic cells analysis for all cell lines with density variations. We have chosen to give greater importance to the new cell lines established by the fact that they have not yet been investigated in relation to the occurrence or not of bystander effect. It was confirmed by this work that, for the new cell lines, the bystander effect varies in relation to the radiation doses, cell density and time in which non-irradiated cells are kept in contact with the irradiated medium.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:48:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:57:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:48:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:57:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 09063.pdf: 2967204 bytes, checksum: 97bf7db9915ce473f9c3b95b67930979 (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:48:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:57:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Neste estudo, foi determinado o dano celular em linfócitos periféricos após exposição ao 153Sm-EDTMP (Samário-153 etilenodiaminotetrametilenofosfonato) por meio da técnica de análise de micronúcleos e coloração diferencial. O 153Sm-EDTMP é um radiofármaco utilizado para alívio da dor em pacientes com metástase óssea. A análise da freqüência de micronúcleos em amostras sangüíneas de pacientes obtidas uma hora após a administração endovenosa do radiofármaco (41 MBq/kg) mostrou que não houve diferença estatística em relação aos valores basais em células binucleadas. Porém, a análise da distribuição do dano em células mononucleadas mostrou que os pacientes sem tratamento radioterápico prévio apresentaram um aumento significativo na freqüência de células com um micronúcleo e aqueles com tratamento radioterápico prévio, nas células com dois ou mais micronúcleos. Os experimentos in vitro realizados com exposição de sangue total a três concentrações radioativas de 153Sm-EDTMP (0,370; 0,555 e 1,110 MBq/mL) por uma hora mostraram um aumento na freqüência de micronúcleos e de células necróticas e apoptóticas com o aumento da dose de radiação. Foram construídas curvas dose-resposta para os indivíduos sadios e para os pacientes com metástases óssea sem prévio tratamento radioterápico. A comparação das curvas mostrou que os pacientes apresentaram uma radiossensibilidade mais alta que os indivíduos sadios tanto quanto a porcentagem de células com micronúcleos como de células mortas (necróticas e apoptóticas). / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:48:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:57:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 09063.pdf: 2967204 bytes, checksum: 97bf7db9915ce473f9c3b95b67930979 (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Neste estudo, foi determinado o dano celular em linfócitos periféricos após exposição ao 153Sm-EDTMP (Samário-153 etilenodiaminotetrametilenofosfonato) por meio da técnica de análise de micronúcleos e coloração diferencial. O 153Sm-EDTMP é um radiofármaco utilizado para alívio da dor em pacientes com metástase óssea. A análise da freqüência de micronúcleos em amostras sangüíneas de pacientes obtidas uma hora após a administração endovenosa do radiofármaco (41 MBq/kg) mostrou que não houve diferença estatística em relação aos valores basais em células binucleadas. Porém, a análise da distribuição do dano em células mononucleadas mostrou que os pacientes sem tratamento radioterápico prévio apresentaram um aumento significativo na freqüência de células com um micronúcleo e aqueles com tratamento radioterápico prévio, nas células com dois ou mais micronúcleos. Os experimentos in vitro realizados com exposição de sangue total a três concentrações radioativas de 153Sm-EDTMP (0,370; 0,555 e 1,110 MBq/mL) por uma hora mostraram um aumento na freqüência de micronúcleos e de células necróticas e apoptóticas com o aumento da dose de radiação. Foram construídas curvas dose-resposta para os indivíduos sadios e para os pacientes com metástases óssea sem prévio tratamento radioterápico. A comparação das curvas mostrou que os pacientes apresentaram uma radiossensibilidade mais alta que os indivíduos sadios tanto quanto a porcentagem de células com micronúcleos como de células mortas (necróticas e apoptóticas). / In this study the cellular damage in peripheral lymphocytes after exposure to 153Sm-EDTMP (Samarium-153 ethylenediaminetetrametylenephosphonate) was determined using the technique of micronuclei analysis and differential coloration. 153Sm- EDTMP is a radiopharmaceutical used for pain relief in patients with bone metastases. The analysis of the frequency of micronuclei in patient blood samples obtained one hour after endovenous administration of radiopharmaceutical (41 MBq/kg) showed no statistical difference in relation to basal values in binucleated cells. However the analysis of damage distribution in mononucleated cells, showed that the patients without previous radiotherapic treatment presented a significant increase in the frequency of cells with one micronucleus and in those who had taken previous radiotherapic treatment, in cells with two or more micronuclei. The in vitro experiments conducted with the exposition of total blood to three radiation concentrations of 153Sm-EDTMP (0.370, 0.555 and 1.110 MBq/mL) during one hour showed an increase in the frequency of micronuclei and necrotic and apoptotic cells with increasing radiation dose. Dose-response curves for healthy donors and patients with bone metastasis without previous radiotherapic treatment were constructed. The comparison of the curves showed that patients presented higher radiosensitivity, either micronuclei or dead cell (necrotic or apoptotic) percentages, than healthy donors.

Neste estudo, foi determinado o dano celular em linfócitos periféricos após exposição ao 153Sm-EDTMP (Samário-153 etilenodiaminotetrametilenofosfonato) por meio da técnica de análise de micronúcleos e coloração diferencial. O 153Sm-EDTMP é um radiofármaco utilizado para alívio da dor em pacientes com metástase óssea. A análise da freqüência de micronúcleos em amostras sangüíneas de pacientes obtidas uma hora após a administração endovenosa do radiofármaco (41 MBq/kg) mostrou que não houve diferença estatística em relação aos valores basais em células binucleadas. Porém, a análise da distribuição do dano em células mononucleadas mostrou que os pacientes sem tratamento radioterápico prévio apresentaram um aumento significativo na freqüência de células com um micronúcleo e aqueles com tratamento radioterápico prévio, nas células com dois ou mais micronúcleos. Os experimentos in vitro realizados com exposição de sangue total a três concentrações radioativas de 153Sm-EDTMP (0,370; 0,555 e 1,110 MBq/mL) por uma hora mostraram um aumento na freqüência de micronúcleos e de células necróticas e apoptóticas com o aumento da dose de radiação. Foram construídas curvas dose-resposta para os indivíduos sadios e para os pacientes com metástases óssea sem prévio tratamento radioterápico. A comparação das curvas mostrou que os pacientes apresentaram uma radiossensibilidade mais alta que os indivíduos sadios tanto quanto a porcentagem de células com micronúcleos como de células mortas (necróticas e apoptóticas). / In this study the cellular damage in peripheral lymphocytes after exposure to 153Sm-EDTMP (Samarium-153 ethylenediaminetetrametylenephosphonate) was determined using the technique of micronuclei analysis and differential coloration. 153Sm- EDTMP is a radiopharmaceutical used for pain relief in patients with bone metastases. The analysis of the frequency of micronuclei in patient blood samples obtained one hour after endovenous administration of radiopharmaceutical (41 MBq/kg) showed no statistical difference in relation to basal values in binucleated cells. However the analysis of damage distribution in mononucleated cells, showed that the patients without previous radiotherapic treatment presented a significant increase in the frequency of cells with one micronucleus and in those who had taken previous radiotherapic treatment, in cells with two or more micronuclei. The in vitro experiments conducted with the exposition of total blood to three radiation concentrations of 153Sm-EDTMP (0.370, 0.555 and 1.110 MBq/mL) during one hour showed an increase in the frequency of micronuclei and necrotic and apoptotic cells with increasing radiation dose. Dose-response curves for healthy donors and patients with bone metastasis without previous radiotherapic treatment were constructed. The comparison of the curves showed that patients presented higher radiosensitivity, either micronuclei or dead cell (necrotic or apoptotic) percentages, than healthy donors.

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Malgré les progrès en matière de greffe de cellules souches hématopoïétique (GCSH), environ 40% des enfants atteints d’une leucémie aigüe lymphoblastique (LAL) réfractaire à la chimiothérapie ne peuvent être guéris. Notre laboratoire a démontré que l’effet précoce de greffe contre leucémie (GvL) est significativement augmenté par les cellules Natural Killer (NK) stimulées par des cellules plasmacytoïdes dendritiques (pDC). Une nouvelle thérapie cellulaire adoptive basée sur la stimulation des cellules NK par les pDC a été développée et son efficacité a été démontrée dans un modèle de souris humanisées. Des cellules hautement spécialisées appelées « Therapeutic Inducers of Natural Killer cell Killing » (ThINKK), analogues des pDC, sont produites à partir de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon. Afin d’amener les ThINKK vers un usage clinique, ce projet avait comme objectif d’en compléter la caractérisation, d’investiguer leurs effets secondaires potentiels après transfert adoptif dans le contexte de transplantation hématopoïétique allogénique et d’évaluer l’impact d’un régime prophylactique immunosuppresseur sur l’axe ThINKK/cellules NK. L’identité cellulaire des ThINKK a été déterminée par cytométrie de flux et par analyse unicellulaire du transcriptome (scRNA-seq). Pour déterminer si la présence des ThINKK pourrait augmenter l’activation et la prolifération des cellules T allogéniques, nous avons utilisé des réactions lymphocytaires mixtes (MLR) dans lesquelles les cellules T et les ThINKK ont été cultivées en présence de cellules présentatrices d’antigènes. Un modèle murin de réaction de greffe contre l’hôte (xéno-GvHD) nous a permis de déterminer l’impact du transfert adoptif de ThINKK sur la GvHD in vivo. Finalement, nous avons testé l’effet d’immunosuppresseurs sur la cytotoxicité des cellules NK activées par ThINKK contre des cellules LAL. Nos résultats démontrent que les ThINKK n’expriment pas les marqueurs associés aux cellules présentatrices d’antigènes, mais expriment les marqueurs des cellules plasmacytoïdes dendritiques. L’analyse des résultats de scRNA-seq démontre la présence d’une sous-population cellulaire mineure exprimant le récepteur AXL, sans toutefois exprimer les autres marqueurs conventionnels des cellules présentatrices d’antigènes. Les ThINKK, incluant la sous-population AXL-positive, n’exacerbent pas l’activation ou la prolifération des cellules T allogéniques in vitro ou in vivo. Finalement, des cinq immunosuppresseurs testés, seules la cyclosporine A et de la méthylprednisolone diminuaient l’activation et la cytotoxicité des cellules NK induites par les ThINKK. Nos résultats suggèrent qu’une immunothérapie par transfert adoptif de ThINKK serait sécuritaire chez les patients ayant reçu une greffe allogénique. L’utilisation d’un régime prophylactique immunosuppresseur est également possible sans affecter l’efficacité de cette nouvelle immunothérapie post-transplantation. / The survival outcomes of children with relapsed acute lymphoblastic leukemia (ALL) remain dismal despite progress in hematopoietic stem cell transplantation. In the past, our team has demonstrated that the stimulation of Natural Killer (NK) cells with a subset of plasmacitoid dendritic cells (pDCs) called Therapeutic Inducers of Natural Killer cell Killing (ThINKK) improved the early graft-versus-leukemia effect and controlled ALL development in humanized mice. ThINKK are expanded from cord blood hematopoietic stem cell progenitors for adoptive post-transplant immunotherapy. To translate these findings into the clinic, the main objectives of this project was to further characterize the ThINKK phenotype, to investigate the potential adverse effects of ThINKK in the context of allogeneic hematopoietic transplantation, and to evaluate the functional impact of the post-transplant prophylactic immunosuppressive regimen on the ThINKK/NK cell axis. The cellular identity of ThINKK was assessed using flow cytometry and single-cell RNA sequencing. To assess the potential exacerbation of T-cell activation and proliferation by ThINKK, allogeneic T cells and ThINKK were co-cultured with or without antigen-presenting cells in mixed lymphocyte reactions (MLR). We used a xenograft mouse model to evaluate the efficacy and potential side effects of an adoptive transfer of ThINKK on graft-versus-host reactions in vivo. Finally, we tested the effect of immunosuppressive drugs on ThINKK-induced NK cell cytotoxicity against ALL cells. We found that ThINKK cells did not express antigen-presenting cell markers but expressed pDCs lineage markers. Single-cell RNA sequencing analysis revealed the presence of a minor cell subset expressing the AXL receptor gene, but lacking expression of other conventional dendritic cell marker genes. Importantly, ThINKK including the AXL+ subset did not exacerbate allogeneic T-cell activation and proliferation in vitro and in vivo. Finally, out of the five immunosuppressive drugs tested, only cyclosporine A and methylprednisolone decreased ThINKK-induced NK cell activation and cytotoxicity. Our results support that ThINKK cell transfer immunotherapy could be safe in transplanted subjects even in allogeneic settings and that a prophylactic immunosuppressive regimen may be used without affecting the efficacy of this novel post-transplant immunotherapy.