Les microtubules (MTs) sont des éléments majeurs du cytosquelette, ils participent à un ensemble de fonctions cellulaires d’importance comme la migration, le trafic des vésicules et des organelles ainsi qu’{ la division cellulaire au cours de laquelle ils forment le fuseau mitotique, permettant une ségrégation correcte des chromosomes. Ce sont des polymères cylindriques composés de protofilaments parallèles faits d’hétérodimères de tubulines α/β. Pour exercer ces fonctions, les MTs nécessitent une dynamique d’assemblage et de désassemblage régulée.La stathmine est une phosphoprotéine cytosolique de 17 kDa qui séquestre la tubuline dans un complexe non polymérisable formé de deux hétérodimères de tubuline par molécule de stathmine (complexe T2S). Les autres protéines de la famille stathmine (SCG10, SCLIP, RB3 et ses deux variants d’épissage RB3' et RB3″) forment aussi des complexes de séquestration appelés T2-SLD (Stathmin Like Domain) ayant des stabilités variables.En s’appuyant sur ces observations, des travaux ont montré qu’une chimère SN-CR constituée de la partie N-terminale de la stathmine et de la partie C-terminale du SLD de la protéine RB3 forme un complexe T2S remarquablement stable avec la tubuline (Jourdain et al., 2004). En parallèle à ces travaux, Clément et collaborateurs ont découvert que de courts peptides issus de la région N-terminale des SLD peuvent à eux seuls inhiber la polymérisation de la tubuline. Le peptide le plus efficace est le peptide I19L issu de la stathmine (peptide I19L (IQVKELEKRASGQAFELIL)). Il correspond à la région repliée en «β-hairpin» observée dans les cristaux T2S-SLD formés avec le domaine RB3-SLD (Clement et al., 2005). Pour augmenter l'efficacité de l’interaction entre les peptides issus de la région N-terminale des SLD et la tubuline, différentes mutations ont été introduites au niveau du peptide I19L. Les expériences de polymérisation in vitro de tubuline en présence d’une série de mutants de peptide I19L montrent que les peptides I19L-K4R et I19L-K4R-A10R sont les plus efficaces pour l’inhibition de l’assemblage de la tubuline.L’objectif de mes travaux { été d’introduire ces mutations au niveau de la partie N-terminale de la protéine stathmine et de la chimère NS-CR, afin d’analyser leurs efficacités sur l’inhibition de l’assemblage des MTs et la dynamique des MTs dans des cellules en culture de type HeLa, et de voir leur impact sur le cycle cellulaire.Mes résultats montrent que la stathmine mutant 2 (possédant les mutations K9R-A15R homologues aux mutations K4R-A10R du peptide I19L) induit une dépolymérisation des MTs dans des cellules en mitose par formation de fagots de MTs, réduit la dynamique de MTs et induit une cytotoxicité. L’ensemble des résultats suggère que nous pouvons améliorer la stabilité de liaison de la stathmine avec la tubuline par l’introduction de ces mutations, ce qui aurait in vitro un impact dans certains aspects cellulaires comme la prolifération cellulaire et la dynamique des MTs. Cela pourrait conduire à développer de nouvelles stratégies anticancéreuses visant à perturber le fuseau mitotique. / Microtubules (MTs) are major constituents of the cytoskeleton and are involved in many cellular processes such as the determination of cell architecture, the formation of the mitotic spindle and intracellular trafficking. These tubular structures, composed by tubulin α/β heterodimers assemble and disassemble with a finely regulated dynamics.Stathmin is a cytosolic phosphoprotein that sequesters tubulin in a non polymerizable complex consisting of two tubulin heterodimers per stathmin molecule (T2S complex).The other stathmin family proteins (SCG10, SCLIP, RB3 and its two splice variants RB3 'and RB3 ") can also bind two tubulin heterodimers through their SLD (Stathmin Like Domain), but the different tubulin/SLD complexes display varying stabilities.Based on these observations, current works showed that one chimera protein consisting of the N-terminal domain of stathmin (NS) and of the C-terminal domain of RB3 (CR) forms a T2-SLD complex remarkably stable with tubulin (NS-CR chimera). Molecular simulation experiments in silico suggest that we can increase the affinity of the NS-CR chimera by introducing mutations in the NS subdomain (Jourdain et al., 2004).In parallel to this work, Clement and colleagues found that short peptides derived from the N-terminal region of SLD alone can inhibit tubulin polymerization. Among the N-terminal part of SLD, the most effective peptide is the peptide I19L (IQVKELEKRASGQAFELIL) derived from stathmin. It corresponds to region folded into a "β-hairpin" structure observed in the T2S crystals (Clement et al., 2005). To increase the efficiency of this interaction, different mutations were introduced at the level of the I19L peptide from the stathmin N-terminal domain and tested in vitro. The results showed that the peptides I19L-K4R and I19L-K4R-A10R are the most effective to in inhibit the assembly of MTs.In this work, we introduce these mutations in the N-terminal domains of stathmin and in the NS-CR chimera with the aim of analyzing their efficiencies on MTs disassembly in cancer cell cultures like HeLa, and the impact of the mutation on MTs dynamic and cell cycle.Results from overexpression experiments of WT and stathmin mutant 2 containing the double mutation (K9R-A15R similar to the mutations K4R-A10R for the I19L peptide), suggest that this mutant significantly induces depolymerization of mitotic MTs. In its less phosphorylated state on serine 16; this mutation also reduces MTs dynamics and induces cytotoxicity.We thus suggest that we can ameliorate the binding and efficiency of the N-terminal stathmin part by including this double mutation. This variation has an impact in vitro and in some cellular aspects such as cell proliferation and MTs dynamics. These findings may lead to a targeted therapy for this type of cancer.

Staphylococcus aureus est une bactérie Gram positive qui colonise la peau des animaux et des humains sains. Dans certaines conditions, telles que la perturbation du microbiote, S. aureus peut induire différentes maladies en déjouant les fonctions de défenses de la cellule hôte. Récemment, notre équipe a montré que les S. aureus méthiciline-résistant (MRSA) souche MW2 (USA400) étaient capables d’induire un retard de la transition de phase G2/M des cellules HeLa. Dans ce travail, nous avons démontré que cette action est initiée par des composants du surnagent de culture de S. aureus.Différentes fractions de surnagents de culture de MW2 ont été obtenues par la chromatographie d’exclusion et analysées par la spectrométrie de masse. Ces techniques nous ont permis d’identifier les peptides phenol-soluble modulins alpha (PSMa) comme responsables du retard du cycle cellulaire des cellules hôtes. Confirmant l’implication de ces modulines, la souche LAC¿psma déficiente en PSMa 1 – 4, n’a pas affecté la progression normale du cyle cellulaire de cellules epitheliales HeLa. De plus, le traitement de ces cellules avec des PSMa1 et PSMa3 synthétiques a induit un retard de la transition de phase G2/M qui a été associé à la diminution de l’expression de gènes codant des défensines ß. Enfin, nous avons démontré que la souche MW2 diminue le niveau d’optineurine et d’optineurine phosphorylée sur la sérine-177, une protéine hôte qui est impliquée dans la transition de phase G2/M. Ce travail représente une étape importante de la compréhension du mécanisme d’interférence de S. aureus / Staphylococcus aureus is a Gram-positive bacterium that colonizes the skin of healthy animals and humans. In certain conditions, including the disruption of the commensal microbiota, S aureus can cause different diseases by deviating the host defense functions. Recently, our group has shown that the methicillin-resistant S. aureus (MRSA) MW2 (USA400) strain causes delay in the transition of the G2/M phase of HeLa cells. In the present work, we demonstrated that this action is initiated by components of the supernatant of the S. aureus culture. Different supernatant fractions were obtained by size exclusion chromatography and were analyzed by mass spectrometry, which allowed to identify phenol-soluble modulins alpha (PSMa) as responsible for the host cell cycle delay.Confirming the involvement of these modulins in the delay, the MRSA LAC¿psma strain, which is deficient in PSMa1–4, did not affect the normal progression of the cycle in HeLa cells. In addition, the treatment of these cells with synthetic PSMa1 and PSMa3 caused delay in the transition of the G2/M phase associated with the decreased production of host ß-defensins. Lastly, we demonstrated that the MW2 strain, which produce PSMa, decreases the level of optineurin and optineurin phosphorylated at serine 177, a host protein that is involved in the G2/M phase transition. The work conducted in this thesis represents an important achievement in the understanding of how S. aureus interferes with the host cell cycle, revealing a new role for PSMa produced by this bacterium.