L'objectif de ce travail était de mettre au point un système de culture tridimensionnel compartimenté pour la différentiation de cellules neurales et la croissance des neurites en 3D. Les matériaux biomimétiques permettent l'élaboration de microenvironnements contrôlés qui peuvent orienter la réponse cellulaire. Ils sont particulièrement intéressants pour les études fondamentales visant à étudier des voies de signalisation impliquées dans des processus physiologiques ou pathologiques. Nous nous sommes intéressés à la maladie d'Alzheimer, où l'on observe des neurites dystrophiques associés aux plaques amyloïdes. Aucune relation n'a été réellement établie entre l'interaction neurites - agrégats, leur dystrophie et la mort neuronale. Dans un premier temps, nous avons décrit et caractérisé la structure et les propriétés de matrices de collagène fibrillaire d'épaisseur calibrée. Ensuite, nous avons mis au point la fonctionnalisation de ces matrices avec des facteurs de croissance neurotrophiques (NGF et BDNF). Deux techniques ont été étudiées : l'imprégnation/libération et le couplage covalent. Ces matrices fonctionnalisées ont été validées comme support pour la différenciation de cellules nerveuses (PC-12 et SH-SY5Y) par des études de la morphologie cellulaire. Enfin, nous avons caractérisé des agrégats amyloïdes (Aβ) formés à l'intérieur des matrices de collagène par co-précipitation du peptide Aβ avec le collagène et nous avons étudié leur toxicité sur les cellules neurales. / The objective of this work was to develop a 3D compartmented cell culture set-up that allow the differentiation of nerve cells and the growth of neurites in the matrix depth. Biomimetic materials enable the formation of controlled microenvironments that orient cell behavior. They are particularly interesting for fundamental studies that aim to study signaling pathways involved in physiologic or pathologic processes. We focused on Alzheimer's disease, in which dystrophic neurites are associated to amyloid plaques. No direct relationship has yet been established between Aβ aggregates-neurite interaction, neurite dystrophy and cell death. First, we described and characterized the structure and properties of fibrillar collagen matrices with adapted thickness. Then, we adjusted functionalization of these matrices with neurotrophic growth factors (NGF and BDNF). Two methods were studied: impregnation/release and covalent coupling. Cell morphology studies confirmed that these functionalized matrices were efficient supports for nerve cells differentiation (PC-12 and SH-SY5Y). Finally, we have characterized Aβ aggregates that were formed inside collagen matrices by coprecipitation of amyloid peptide and collagen and we studied their toxicity on neural cells.

La mucopolysaccharidose de type IIIB (MPSIIIB), ou maladie de Sanfilippo B, est une maladie de surcharge lysosomale caractérisée par des atteintes neurologiques. Cette maladie génétique rare est causée par la déficience en a-N-acétylglucosaminidase (NAGLU), une enzyme nécessaire pour la dégradation des héparanes sulfates (HS). La dégradation incomplète des HS cause l'accumulation de saccharides d'HS dans les lysosomes et à la surface des cellules. Mais la cascade physiopathologique induite par ces saccharides n'est pour l'instant pas connue. D'une part, ces recherches fournissent des preuves que la communication avec l'environnement des cellules neurales déficientes en NAGLU est altérée. En effet, l'intégrine ß1 et ses effecteurs sont suractivés et recrutés au niveau des plaques d'adhérence dans des astrocytes déficients. Les comportements cellulaires dépendants des intégrines, tels que la polarisation et la migration, sont également altérés. Ces phénotypes sont restaurés par l'apport de l'enzyme déficiente. Cette restauration indique que l'accumulation de saccharides d'HS provoque l'activation de la signalisation des intégrines, et perturbe la polarisation et la migration des cellules neurales. L'ajout de saccharides d'HS purifiés sur des cellules neurales normales confirme que les saccharides d'HS extracellulaires activent des composants des plaques d'adhérence. D'autre part, l'étude d'un modèle cellulaire humain, dont l'expression de NAGLU a été inhibée par shRNA, a montré que l'accumulation de vésicules de stockage caractéristiques de la maladie est causée, entre autre, par une déformation de l'appareil de Golgi et la surexpression de GM130. Ces phénotypes sont également observés dans les neurones atteints. Ils s'accompagnent d'une augmentation de la stabilité et de la nucléation des microtubules, au niveau de l'appareil de Golgi. Les défauts de communication entre la cellule malade et son environnement semblent donc modifier la dynamique et la structure cellulaire. Nous présumons que les mécanismes physiopathologiques déchiffrés en culture sont reliés à la neuropathologie de la MPSIIIB. En perturbant la perception de l'environnement cellulaire, la polarité, la migration, et la pousse neuritique, les saccharides d'HS accumulés dans les tissus cérébraux malades, affectent probablement divers mécanismes clefs de la maturation corticale.

La mucopolysaccharidose de type IIIB (MPSIIIB), ou maladie de Sanfilippo B, est une maladie de surcharge lysosomale caractérisée par des atteintes neurologiques. Cette maladie génétique rare est causée par la déficience en a-N-acétylglucosaminidase (NAGLU), une enzyme nécessaire pour la dégradation des héparanes sulfates (HS). La dégradation incomplète des HS cause l’accumulation de saccharides d’HS dans les lysosomes et à la surface des cellules. Mais la cascade physiopathologique induite par ces saccharides n’est pour l’instant pas connue. D’une part, ces recherches fournissent des preuves que la communication avec l’environnement des cellules neurales déficientes en NAGLU est altérée. En effet, l’intégrine ß1 et ses effecteurs sont suractivés et recrutés au niveau des plaques d’adhérence dans des astrocytes déficients. Les comportements cellulaires dépendants des intégrines, tels que la polarisation et la migration, sont également altérés. Ces phénotypes sont restaurés par l’apport de l’enzyme déficiente. Cette restauration indique que l’accumulation de saccharides d’HS provoque l’activation de la signalisation des intégrines, et perturbe la polarisation et la migration des cellules neurales. L’ajout de saccharides d’HS purifiés sur des cellules neurales normales confirme que les saccharides d’HS extracellulaires activent des composants des plaques d’adhérence. D’autre part, l’étude d’un modèle cellulaire humain, dont l’expression de NAGLU a été inhibée par shRNA, a montré que l’accumulation de vésicules de stockage caractéristiques de la maladie est causée, entre autre, par une déformation de l’appareil de Golgi et la surexpression de GM130. Ces phénotypes sont également observés dans les neurones atteints. Ils s’accompagnent d’une augmentation de la stabilité et de la nucléation des microtubules, au niveau de l’appareil de Golgi. Les défauts de communication entre la cellule malade et son environnement semblent donc modifier la dynamique et la structure cellulaire. Nous présumons que les mécanismes physiopathologiques déchiffrés en culture sont reliés à la neuropathologie de la MPSIIIB. En perturbant la perception de l’environnement cellulaire, la polarité, la migration, et la pousse neuritique, les saccharides d’HS accumulés dans les tissus cérébraux malades, affectent probablement divers mécanismes clefs de la maturation corticale. / Mucopolysaccharidosis type IIIB (Sanfilippo B disease) is a lysosomal storage disease characterized by severe neurological manifestations in children. This rare monogenic disease is caused by a-N­acetylglucosaminidase (NAGLU) deficiency, a lysosomal hydrolase necessary for heparan sulfate (HS) degradation. This deficiency leads to the accumulation of HS saccharides. Mechanisms mediating HS saccharides deleterious effects on brain cells are not well understood. This research provides evidences that neural cell sensing of environment is altered in MPSIIIB cells. Integrins and focal adhesion components are over-recruited and over-activated in deficient mouse astrocytes. Consistently, integrin-dependant cell behavior such as cell polarization and directed migration were defective in affected astrocytes and neural stem cells. HS saccharide clearance, by NAGLU gene transfer, rescues a normal phenotype suggesting that HS saccharides induce focal adhesion formation. Addition of purified HS saccharides on normal astrocytes confirms that extracellular HS saccharides can activate the recruitment of focal adhesion components and provides an in vitro assay to decipher the saccharide code of HS. Otherwise, investigations performed on HeLa cell model, in which NAGLU expression was inhibited by shRNA, showed that accumulation of intracellular storage vesicles, a hallmark of the disease, is due over expression of a cis-Golgi protein. This affects the Golgi morphology and microtubule nucleation and stability. It seems that alterations of environment cell sensing and downstream signaling also modify the dynamic and the structure of cells. We assume that mechanisms deciphered in cell cultures are related to MPSIIIB neuropathology. By affecting cell perception of environmental cues, cell polarity, cell migration and neurite outgrowth, HS saccharides, which accumulate in brain tissues defective for a HS degradation enzyme, likely affect various processes important for accurate cortical maturation.