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Functionalization of biomaterials : bi-functional peptides and polyelectrolyte multilayers / Fonctionnalisation de biomatériaux : peptides bi-fonctionnels et films de polyélectrolytesPanayotov, Ivan Vladislavov 16 December 2013 (has links)
Cette thèse concerne la fonctionnalisation des biomatériaux, le titane et l'alliage de titane Ti6Al4V ainsi que le PEEK (Poly-Éther-Éther-Ketone) pour l'application de ces biomatériaux dans les domaines de l'implantologie dentaire et de la reconstruction maxillo-faciale. Au cours de la première partie de ce travail nous avons synthétisé quatre peptides bi-fonctionnels avec une grande affinité pour la surface implantaire de Ti et de Ti6Al4V et également pour les kératinocytes oraux. La spectroscopie de force de la cellule unique (Single Cell Force Spectroscopy - AFM) a été utilisée pour étudier l'adhésion d'une cellule sur les surfaces fonctionnalisées par les quatre peptides bi-fonctionnels. A l'aide du test colorimétrique de para-nitrophenyl phosphate (pNPP) on a démontré l'adhésion des kératynocytes après 4 heures d'incubation sur les surfaces fonctionnalisées avec les peptides bi-fonctionnels. Les résultats de ces études ont démontré la présence d'un peptide bi-fonctionnel qui augmente l'adhésion cellulaire instantanée et l'adhésion 4h après incubation des kératinocytes oraux sur les métaux. Ce peptide résiste à l'influence de facteurs externes tels que l'adsorption d'albumine et représente une proposition prometteuse pour la fonctionnalisation de l'implant de Ti et de Ti6Al4V. La deuxième partie de notre mémoire de thèse décrit une méthode de dépôt par spray des films des multicouches de PLL/PGA (poly-l-lysine/acide polyglutamique), des protéines et des cellules souches pulpaires. Les outils de spray d'usage unique ont été adaptés aux exigences de la bonne pratique de fabrication (GMP - good manufacturing practice). Les premiers tests de prolifération cellulaire ont démontré qu'elle n'a pas été affectée par le spray. L'étude en AFM a démontré que la rugosité et l'épaisseur du film augmentaient exponentiellement avec l'augmentation du nombre des couches déposées. Le traitement physique par UV rayonnement ainsi que le traitement par la déshydratation et la réhydratation des films ont provoqué des changements dans l'épaisseur, l'élasticité et la dureté des films. Le dépôt des protéines sur les MPEs a aussi augmenté l'épaisseur et a influencé la dureté de la surface. Les changements chimiques de la structure des MPEs après le traitement physique et après le dépôt des protéines naturelles ont été étudiés par la spectroscopie Raman. La prolifération cellulaire au 1er, 3e et 8e jours après leur spray sur des films de MPEs et des protéines a été ensuite évaluée. Les MPEs traitées par UV combiné avec déshydratation/réhydratation ainsi que les PEMs couvertes par protéine - CaP ont entrainé une meilleure adhésion et prolifération cellulaires que les MPEs non-traitées. Finalement la méthode de dépôt par spray des MPEs, protéines et aussi des cellules souches pulpaires a été appliquée sur la surface de PEEK. La meilleure prolifération cellulaire au 8e jour après le spray était sur la surface couverte par le film de (PLL-PGA)5-protéine/CaP. Une étude in vitro sur le degré de minéralisation au 21e jour après l'incubation des cellules pulpaire dans un milieu ostéconductuer sur des différentes (MPEs couvertes-PEEK) surfaces a été effectuée. Les résultats de la microscopie électronique à balayage (MEB), microscopie électronique à transmission (MET), combiné avec des études histologiques ont confirmé la formation d'une matrice extracellulaire minéralisée des autour des cellules pulpaires sur la surface de PEEK. Conclusions: Dans ce travail nous avons décrit une nouvelle approche de fonctionnalisation des surfaces de Ti and Ti6Al4V par des peptides bi-fonctionnels en proposant une séquence prometteuse qui augmente l'adhésion des kératinocytes oraux. Ensuite nous avons développé une méthode de fonctionnalisation de la surface de PEEK par des multicouches de polyeléctrolytes, des protéines naturelles et des cellules souches de la pulpe dentaire. La différentiation ostéoblastique in vitro a été finalement évaluée. / The objective of this thesis was to develop new techniques of surface functionalization of titanium; titanium alloy (Ti6Al4V) and PEEK (poly-ether-ether ketone) surfaces for their application on dental implantology and maxillofacial surgery. During the first part of the thesis we have synthesized four metal binding-cell specific peptides (MCSPs) with high affinity to titanium surface and to oral keratinocytes cells. Single Cell Force Spectroscopy (AFM) was used to study the instantaneous cell adhesion force of keratinicyte cell on MCSPs functionalized surfaces. The colorimetric para-nitrophenyl phosphate (pNPP) essay demonstrates the surface cell adhesion four hours after incubation. The results demonstrate the presence of one bi-functional peptide (MCSP-2) who increases both: the instantaneous and the 4 h cell adhesions. MCSP-2 resist to the influence of external factors like BSA adsorption and could be an interesting candidate for implant surface functionalisation. In the second part of the thesis we have developed a spray deposition method of polyelectrolyte multilayer (PEM) films build. PLL/PGA (poly-l-lysine/poly-glutamic acid) and proteins were used for surface coating. Consequently dental pulp stem cells (DPSC) are sprayed on the PEM films. The aims were to improve a spray -method for cells and the polyelectrolytes deposition on the PEEK implant. The entire spray device was designed for single use, which correspond to good manufacturing practice (GMP) conditions. Cell proliferation in 24 hours after spraying was not disturbed by the spray. Physicochemical properties of PEMs deposited by spray on glass surfaces were performed by Atomic Force Microscopy (AFM) and by contact angle measurements. The results have demonstrated the changes in films thickness and films roughness with increasing numbers of layers corresponding to exponential growth of the films. Physical treatment by UV irradiation and drying-wetting process affects the film thickness and the film elasticity and increases the stiffness of the film. The deposition of protein-CaP and collagen coatings on PEM films increased the layer thickness and influenced the hardness of the surface. Chemical changes in the polyelectrolyte structure during the physical treatment and after proteins deposition were studied by Raman spectroscopy. Cell proliferation of the pulp cells at 1st, 3th and 8th days after pulp cells deposition on PEMs coated glass surfaces, was then evaluated. The results demonstrated that 10 UV/ dray/wetted films and the natural proteins coated films enhanced cell adhesion and cell proliferation. The protein-CaP PEMs covered surface creates the best microenvironment to ensure the cell behavior. Finally PEM films coatings are applied on PEEK implant surface. The AFM study shows the changes of homogeneity and roughness of this surface after PEM film deposition. Contact angle measurement demonstrates decreases of surface hydrophobicity. Cell proliferation of dental pulp stem cells (DPSC) on (PLL-PGA)5-protein/CaP coated PEEK surface was highest compared to other functionalized surfaces. In vitro study of DPSCs osteogenic differentiation was evaluated by the degree of mineralization of the extracellular matrix on the PEEK surface at 21st day after cell incubation. Scanning electron microscopy (SEM), transmission electron microscopy (TEM) combined with histological studies improved the formation of mineralized extracellular matrix and confirmed the osteogenic differentiation of DPSCs on the PEMs coated PEEK surface. Conclusions: In this work we validated the method of Ti and Ti6Al4V functionalization with bi-functional peptides. One peptide that could increase the epithelial cell adhesion to the surface was proposed. Spray deposition technics of PEMs, protein and pulp stem cells were applied for PEEK implant functionalization. Finally we evaluated the differentiation of dental pulp stem cells on the PEEK surface in vitro.
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Periodontal pathobiology and defective cell-autonomous mineralization in X-linked hypophosphatemia / Physiopathologie parodontale et défauts de minéralisation dans le rachitisme vitamino-résistant hypophosphatémiqueCoyac, Benjamin R. 06 April 2017 (has links)
Le rachitisme vitamino-résistant hypophosphatémique (RVRH) est une maladie génétique rare causée par des mutations du gène PHEX. La perte de fonction de la protéine PHEX conduit à l’augmentation du FGF23, une hormone circulante qui agit sur le rein et entraîne une perte systémique de phosphate. Le squelette rachitique des patients atteints de RVRH présente des déformations osseuses et une ostéomalacie. La dentine hypominéralisée des patients est à l’origine d’abcès dentaires fréquents, mais le statut parodontal des patients RVRH est mal connu, de même que leur risque de développer une parodontite pouvant aboutir à la perte des dents. La fonction et le substrat de la protéine PHEX ne sont pas identifiés avec exactitude. Il a été montré in vitro que PHEX avait la capacité d’interagir et de dégrader des protéines membres de la famille des SIBLINGs comme MEPE ou OPN, toutes les deux impliquées dans la régulation de la minéralisation des tissus osseux et dentinaires, mais on ne sait pas si in vivo les défauts de minéralisation observés résultent principalement de l’hypophosphatémie systémique ou bien également des effets directs de l’absence de PHEX sur les protéines régulatrices de la minéralisation. L’objectif de cette thèse a consisté à s’intéresser à la physiopathologie du parodonte dans le RVRH ainsi qu’à déterminer quel était l’impact de la mutation de PHEX dans un modèle de biominéralisation humaine où les conditions de concentration en phosphate pouvaient être ajustées et normalisées. Nous avons d’abord analysé le statut parodontal de 34 patients RVRH dans une étude clinique cas-témoins et ainsi montré que les malades dont la supplémentation en phosphate et vitamine D était tardive ou incomplète présentaient une fréquence et une sévérité accrues de maladie parodontale. Le phénotype parodontal du RVRH a alors été étudié sur des échantillons humains et sur le modèle murin du RVRH, la souris HYP. Nous avons réalisé un modèle d’égression dentaire de façon à permettre une apposition du cément cellulaire, ainsi qu’un modèle de résorption et de réparation osseuses parodontales afin de caractériser l’impact du RVRH sur la physiopathologie parodontale. Nos résultats ont montré que le phénotype parodontal et sa physiopathologie étaient très perturbés dans le rachitisme vitamino-résistant hypophosphatémique et chez la souris HYP, nous avons aussi pu mettre en évidence que le rôle pathologique majeur joué par l’ostéopontine dans le tissu osseux au cours du RVRH ne pouvait pas être généralisé aux autres tissus minéralisés du parodonte. De façon à identifier le rôle de PHEX dans la minéralisation matricielle locale indépendamment de la phosphatémie systémique, nous avons ensemencé des matrices de collagène dense avec des cellules primaires humaines issues de patients RVRH comparés à des contrôles que nous avons cultivés pendant 24 jours en conditions ostéogéniques avec des concentrations en phosphate identiques. Nos résultats ont montré que malgré une concentration normale en phosphate, la perte de fonction de la protéine PHEX entraînait une diminution de la quantité et de la qualité de la phase minérale et une accumulation et une dégradation pathologiques de la protéine OPN. Les contributions originales de ce travail de thèse doctorale ont consisté à démontrer sur le plan clinique et biologique la susceptibilité accrue du rachitisme hypophosphatémique lié à l’X quant au risque de développer une maladie parodontale, ainsi qu’à apporter la preuve d’un rôle pathologique de l’absence de PHEX indépendant de la phosphatémie sur des cultures primaires humaines. / X-linked hypophosphatemia (XLH) is a rare X-linked dominant disorder caused by inactivating mutations in the PHEX gene. The impairment of PHEX protein leads to an increase in FGF23, a circulating factor that causes systemic loss of phosphate. The rachitic skeleton of patients with XLH displays short stature and osteomalacia. Dental defects include poorly mineralized dentin and spontaneous dental abscesses. Little is known about the periodontal condition of XLH and if patients are more prone to develop periodontitis, eventually leading to tooth loss. Although the exact function and substrate of PHEX are not known, it has been shown in vitro that PHEX could interact with SIBLING proteins such as MEPE or OPN, both involved in the regulation of bone and dentin mineralization, but it is not yet clear if the defects in the calcified extracellular matrices of XLH are caused by systemic hypophosphatemia only, or also by local consequences of the absence of PHEX. The aim of this doctoral dissertation was to explore the pathobiology of the XLH periodontium and to determine the impact of PHEX deficiency at the local level in a model of human biomineralization where phosphate supply could be adjusted and normalized. We first examined 34 adults with XLH in a case-control study and observed that periodontitis frequency and severity were increased in individuals with late or incomplete supplementation in phosphate and vitamin D analogs. The periodontium was then analyzed in XLH dental roots and further characterized in the Hyp mouse, the murine model of XLH. We performed a model of tooth movement adaptation leading to the formation of cellular cementum and a model of periodontal breakdown and repair to investigate the impact of XLH on the pathobiology of periodontal tissues. Our results showed strongly affected XLH/Hyp periodontal phenotype and impaired pathobiology and suggested that the key role played by OPN in bone could not be generalized to other periodontal mineralized tissues. In order to determine the role of PHEX in local human mineralization, dense collagen gels were seeded with primary human dental pulp cells harvested from XLH patients displaying PHEX mutations and age-matched healthy individuals. Cell-seeded gels were cultured up to 24 days under osteogenic conditions and controlled phosphate medium concentrations. Our results showed that despite normal phosphate concentrations, PHEX deficiency led to decreased quantity and quality of the mineral phase and a pathologic accumulation and processing of OPN. Overall the original contributions of this doctoral dissertation consist in the demonstration of a higher susceptibility of XLH patients to periodontitis and in the evidence of a local effect of PHEX deficiency in the pathologic intrinsic mineralization from XLH osteogenic cells.
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