Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-12-21T13:54:05Z No. of bitstreams: 1 2015_KarenOfujiOsiro.pdf: 2867423 bytes, checksum: 9d23fe29816120dc28d973b7de26c02f (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-01-25T15:53:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_KarenOfujiOsiro.pdf: 2867423 bytes, checksum: 9d23fe29816120dc28d973b7de26c02f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-25T15:53:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_KarenOfujiOsiro.pdf: 2867423 bytes, checksum: 9d23fe29816120dc28d973b7de26c02f (MD5) / O presente trabalho tem como propósito a purificação de celulossomas, sua caracterização e do secretoma de um novo isolado de Clostridium thermocellum B8, obtido do rúmen de caprino. Para obtenção das amostras proteicas C. thermocellum foi cultivada em meio líquido contendo celulose como fonte de carbono. O secretoma que constitui a amostra de Proteínas Ligadas á Celulose (PLC) foi eluído a partir da celulose residual da cultura. As frações cromatográficas do principal pico de proteína resultante do fracionamento da amostra PLC em uma cromatografia de exclusão molecular (Superdex S-200) compõe a amostra de Celulossomas Parcialmente Purificados (CPP). Ambas as amostras apresentaram atividades enzimáticas celulolíticas e xilanolíticas. As análises de SDS-PAGE, DLS e espectrometria de massa confirmaram que a amostra CPP se trata de um complexo celulossomal, com uma massa molecular estimada de 11,3 MDa ± 4,4 MDa. As proteínas constituintes de CPP foram identificadas por espectrometria de massa LC-MS/MS, levando a identificação de: proteína estrutural (CipA), glicosil hidrolases das famílias 5, 8, 9, 10 e 48 e transportadores do tipo ABC. Na amostra PLC foram identificadas principalmente proteínas envolvidas no catabolismo de polissacarídeos, além de proteínas relacionadas com o mecanismo de transporte de moléculas e processos metabólicos. Dentre as proteínas que têm a função no catabolismo de polissacarídeos, foram identificados glicosil hidrolases das famílias 5, 8, 9, 10, 11, 26, 30, 43 e 53, com atividades de endoglucanase, celobiohidrolases, endoxilanases, endoxilanases com esterase feruloil e acetil com função de xilana esterase, xiloglucanases, arabinoxilanase, glucoxilana xilanahidrolase, arabinofuranosidase, exogalactanase, endogalactanase (arabinogalactana), quitinase, mananase. CPP e PLC apresentaram atividade máxima no intervalo de temperatura entre 60°C-70°C, pH 5.0, e estabilidade térmica a 50, 60 e 70°C, principalmente, no que diz respeito a amostra de PLC. As atividades holocelulolíticas de PLC foram inibidas por compostos fenólicos, enquanto que CPP apresentou um aumento nas atividades de CMCase e xilanase na presença de vários fenóis. A partir dos resultados da sacarificação dos substratos de celulose, palha de cana e piolho de algodão por PLC e CPP, foi observado maiores quantidades de açúcares liberados principalmente a 50°C, em comparação com os dados de 60°C, após 10 dias de incubação. Entretanto, foi observado que após o segundo dia de sacarificação, que os produtos obtidos pela desconstrução de materiais lignocelulósicos, acabam por interferir na velocidade de hidrólise das enzimas de C. thermocellum B8. Em conclusão, este estudo demonstrou potencial para utilização de ambas as amostras (CPP e PLC) de C. thermocellum B8 para hidrolisar biomassas lignocelulósicas, destacando-se o aumento da atividade celulolítica e xilanolítica de CPP na presença de compostos fenólicos, além da termoestabilidade de PLC. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The present work aimed the purification and characterization of the secretome produced by Clostridium thermocellum B8, a novel isolate obtained from goat rumen, after growth on liquid medium containing cellulose as carbon source. The secretome were eluted from the residual substrate, constituting the Protein Linked on Cellulose (PLC) sample. The main protein peak of PLC fractionation onto a molecular exclusion (Superdex S-200) composes the Cellulosomes Partially Purified (CPP) sample. Both samples presented enzymatic activities of cellulases and xylanases. It was elucidated through SDS-PAGE, DLS and mass spectrometry that CPP sample is a cellulosome complex, with an estimated mass of 11,3 MDa ± 4,4 MDa. CPP’s constituting proteins were identified by mass spectrometry LC-MS/MS leading the identification of: scaffolding protein (CipA), glycoside hydrolase proteins classified on the families 5, 8, 9, 10 and 48 and ABC transporter substrate-binding protein. In the PLC sample were identified mostly proteins involved in the catabolism of polysaccharides, besides proteins related to the transport mechanism molecules and metabolic processes. Among the proteins which have catabolism of polysaccharides function, were identified glycosyl hydrolase families 5, 8, 9, 10, 11, 26, 30, 43 and 53 with endoglucanase activity, cellobiohydrolases, endoxylanases, endoxylanases with feruloil esterase and acetyl xylan esterase function, xyloglucanases, arabinoxylanase, glucoxylana xylanhydrolase, arabinofuranosidase, exogalactanase, endogalactanase (arabinogalactan), chitinase, mannanase. CPP and PLC presented maximal activity in the range of 60° to 70°C and pH 5.0, and also those samples have a high thermostability at 50, 60 and 70°C mainly for PLC sample. PLC holocelullolytic activities were inhibited by phenolic compounds, while CPP showed improvement or was less inhibited on its xylanase and CMCase activity in phenols presence. Saccharification results of cellulose, sugarcane straw and cotton gin waste by PLC and CPP, showed highest amounts of sugar released mostly at 50°C in comparison to 60°C and after 10 days of incubation. In summary, this research demonstrated the potential of using CPP and PLC samples of C. thermocellum B8 to hydrolyze lignocellulosic biomasses, with the ability of CPP increase its holocelullolytic activities in the presence of phenolic compounds, and the interesting thermostability of PLC sample, both being valuable for second generation production of biofuels.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Gabriela Lima (gabrieladaduch@gmail.com) on 2017-11-28T14:00:16Z No. of bitstreams: 1 2017_BrendaRabellodeCamargo.pdf: 4900807 bytes, checksum: c27bb67d00e82428ce979800193440bd (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-01-22T20:36:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_BrendaRabellodeCamargo.pdf: 4900807 bytes, checksum: c27bb67d00e82428ce979800193440bd (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-22T20:36:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_BrendaRabellodeCamargo.pdf: 4900807 bytes, checksum: c27bb67d00e82428ce979800193440bd (MD5) Previous issue date: 2018-01-22 / O Brasil possui biomassa de origem lignocelulósica, de abundância, como os resíduos da indústria da cana de açúcar que, podem ser convertidos em produtos de alto valor agregado. Clostridium thermocellum é um microrganismo com grande potencial para degradação de celulose e biomassa lignocelulósica, devido à capacidade dessa bactéria em secretar um complexo multi-enzimático (celulossoma), formado por um arsenal de enzimas entre glicosil hidrolases, carboidrato esterases, e polissacarídeo liases, considerado carboidrato-ativas. Além disso, essa bactéria fermenta hexoses (C6) e não pentoses (C5), produzindo principalmente etanol, acetato e lactato. A regulação da expressão de genes, regulados pela fonte de carbono, é uma temática de contínuo estudo. Assim, foi realizado o proteoma descritivo de Clostridium thermocellum quando crescido por 96 horas em diferentes fontes de carbono: celulose, bagaço e palha de cana. Foram analisadas diferentes frações de conteúdo de proteína; sobrenadante (FS), ligado ao substrato (FES), e parcialmente purificado em coluna de exclusão molecular (CPP). Em todas as frações foram encontradas proteínas relacionadas à degradação da biomassa, em maior número em amostras de CPP de celulose, seguido pela amostra FES de palha. As exoglucanases CelS, CelK, CbhA, e proteínas estruturais CipA e OlpB foram encontradas em todos os substratos. Na amostra de bagaço foram identificadas as endoglucanases CelN, CelA, CelB, CelR, CelJ, CelQ, CelW, CelG e hemicelulases, Xgh74A, XynC, XynZ, Cthe_0798, sendo a última, presente também em palha. O transcritoma (RNAseq) e análise diferencial dos genes nas mesmas condições, porém em 37 horas, foi realizado. Das proteínas encontradas no proteoma, os genes cthe_0798 e xgh74A foram encontrados diferencialmente expressos em bagaço quando comparado com celulose, seguido pelos genes codificadores de CelP, CtMan5A, CelC, XynA, ManA, Cthe_1257, Cthe_3163 e Orf2p. Genes envolvidos na mobilidade celular, incluindo proteínas de formação de flagelos, motor e regulação, foram encontrados como a categoria (COG N) de maior regulação positiva em bagaço e palha. Na mesma categoria estão genes envolvidos na quimiotaxia e quorum sensing. Durante as análises do transcritoma foi verificada a presença de outra bactéria, Moorella thermoacetica, conhecida por não ser celulolítica, porém com a habilidade de fermentar açúcares C5 e C6. A análise de expressão diferencial de genes nos diferentes tratamentos, mostrou moth_0612 e moth_0699 regulados positivamente em bagaço, ambos codificando transportadores de ribose (C5). A análise de proteínas ortólogas entre as duas bactérias revelou que M.thermoacética não possui ortólogos com potenciais de atuar como enzimas carboidrato ativas de C.thermocellum. Relativo à C.thermocellum, o gene cthe_2196, ausente de caracterização, contendo os domínios GH43, CBM6 e Doquerina tipo I, foi encontrado expresso em bagaço e palha, ausente em celulose, além de ser predito como fazendo parte de um operon juntamente com cthe_2195. Cthe_2196, foi clonado em sistema pET, expresso em E.coli, e a proteína denominada AxB8 foi caracterizada bioquimicamente. AxB8 possui habilidade de degradar arabinoxilana e substratos sintéticos pNP-α-Larabinofuranosidase, e pNP-α-L-arabinofuranosidase. AxB8 apresenta domínio Glicosil hidrolase família 43, subfamília 29, e sua sequência mostrou maior similaridade com outras proteínas de termófilos não caracterizadas. Concluindo, os resultados desse trabalho demonstraram proteínas que são essenciais à degradação de bagaço e palha de cana, além de revelar importantes mecanismos regulados nessas condições que facilitam a proximidade da bactéria com o substrato, como os genes envolvidos na motilidade da bactéria. Essas informações podem ser utilizadas para desenvolvimento de novas linhagens e enzimas que aumentem o processo de degradação de biomassas lignocelulósicas, com o concomitante uso de produtos formados na geração de novas tecnologias. / Lignocellulosic biomass is in abundance in Brazil, as the residues of the sugar cane industry, which can be converted into products with high aggregated value. Clostridium thermocellum is a microorganism with great potential for degradation of cellulose and lignocellulosic biomass due to its ability to secrete a multi-enzymatic complex (cellulosome), formed by an arsenal of enzymes between glycosyl hydrolases, carbohydrate esterases, and polysaccharide lyases, considered Carbohydrate-active. In addition, this bacterium ferments hexoses (C6) and not pentoses (C5), mainly producing ethanol, acetate, and lactate. Metabolism gene expression, regulated by the carbon source, is a subject of continuous study. Thus, the descriptive proteome of Clostridium thermocellum was carried out when grown for 96 hours in different carbon sources: cellulose, bagasse and cane straw. Different fractions of protein content were analyzed; Supernatant (FS), bound to the substrate (FES) and partially purified by size exclusion chromatography (CPP). In all the fractions were found proteins related to the degradation of the biomass, in greater number in samples of cellulose CPP, followed by straw FES. The exoglucanases CelS, CelK, CbhA, and structural proteins CipA and OlpB were found in all substrates. In the bagasse sample the endoglucanases CelN, CelA, CelB, CelR, CelJ, CelQ, CelW, CelW, CelG and hemicellulases, Xgh74A, XynC, XynZ, Cthe_0798 were identified, the latter being also present in straw. Transcriptomic (RNAseq) and differential analysis of the genes under the same conditions, but growth at 37 hours, was performed. From the proteins found in the proteome, the encoding genes cthe_0798 and xgh74A were differentially expressed as bagasse when compared to cellulose, followed by the genes encoding CelP, CtMan5A, CelC, XynA, ManA, Cthe_1257, Cthe_3163 and Orf2p. Genes involved in cell motility(COG N), including flagella, motor and regulation proteins, were found in the highest category of up-regulation in bagasse and straw. In the same category were genes involved in chemotaxis and quorum sensing. During ranscriptomic analysis, was detected the presence of another bacterium, Moorella thermoacetica, knowing to be not ellulolytic, but having the ability to ferment C5 and C6 sugars. Differential gene expression in different treatments showed moth_0612 and moth_0699 up-regulated in bagasse, both encoding ribose (C5) transporters. Orthologous proteins analysis between the two bacteria revealed that M.thermoacética did not have orthologs with the potential to act as active carbohydrate enzymes from C.thermocellum. Regarding C.thermocellum, the cthe_2196 gene, absent from characterization, containing the domains GH43, CBM6 and Dockerin type I, was found expressed in bagasse and straw, but absent in cellulose, besides being predicted as part of an operon together with cthe_2195. Cthe_2196 was cloned into pET system, further expressed in E. coli, and the protein named AxB8 was characterized biochemically. AxB8 has the ability to degrade arabinoxylan and synthetic substrates pNP-α-L-arabinofuranosidase, and pNP-α-Larabinofuranosidase. AxB8 contains Glycosyl hydrolase family domain 43, subfamily 29, and its sequence showed greater similarity with other non-characterized thermophilic proteins. In conclusion, the results of this work demonstrated proteins that are essential for the degradation of sugarcane bagasse and straw, besides revealing important regulated mechanisms due to these conditions that facilitate the proximity of the bacterium with the substrate, as the genes involved in the motility of the bacteria. This information can be used to develop new strains and enzymes that increase the degradation process of lignocellulosic biomasses, with the concomitant use of products formed in the generation of new technologies.