Les mouvements nucléaires sont importants pour une multitude de fonctions cellulaires et sont induits par des forces produites par des protéines moteurs et le cytosquelette. Lors de la formation et régénération de myofibres, les noyaux migrent du centre à la périphérie de la cellule pour son bon fonctionnement. De plus, certaines maladies musculaires sont caractérisées par une accumulation de noyaux centraux. En utilisant une approche théorique et empirique, nous démontrons que le mouvement de noyaux vers la périphérie des myofibres est induit par des forces centripètes autour des noyaux ainsi que par des changements locaux de rigidité nucléaire. Ces forces centripètes sont générées par la contraction de myofibrilles et par leur réticulation autour des noyaux. Les changements de rigidité nucléaire relèvent d’une asymétrie de la distribution de la lamin A/C. En débutant par BIN1, gène muté dans les myopathies centro-nucléés (CNM), nous avons identifié la cascade moléculaire à l’origine du mouvement des noyaux. Nous montrons que l’Amphiphysin 2 (BIN1) est indispensable pour le recrutement de N-WASP, activateur du complexe Arp2/3 afin de promouvoir la polymérisation de l’actine. Cette cascade est nécessaire au mouvement des noyaux vers la périphérie et pour la formation de triades transversales. Cet enchainement est perturbé chez certains patients portant des mutations de BIN1 car cela affecte la bonne localisation de l’Amphiphysin 2. Bien que provenant de la même cascade, le mouvement des noyaux vers la périphérie et la formation transversale de triades sont des processus indépendants. Un complexe de Arp2/3 contenant Arpc5L avec la γ-actine organisent la desmine et donc la réticulation des myofibrilles important pour le mouvement nucléaire. En revanche, un complexe de Arp2/3 contenant Arpc5 avec la β-actine est nécessaires à la formation de triades transversales. / Nuclear movements are important for multiple cellular functions and are driven by forces originating from motor proteins and cytoskeleton. During skeletal myofiber formation or regeneration, nuclei move from the center to the periphery of the myofiber for proper muscle function. Furthermore, centrally located nuclei are found in different muscle disorders. Using theoretical and experimental approaches, we demonstrate that nuclear movement to the periphery of myofibers is mediated by centripetal forces around the nucleus in combination with local changes of nuclear stiffness. The centripetal forces are generated by myofibril contraction, cross-linking and zipping around the nucleus. Local changes of nuclear stiffness are achieved by asymmetric distribution of lamin A/C. Beginning with BIN1, gene mutated in centronuclear myopathies (CNMs); we identified the molecular cascade involved in nuclear movement to the periphery. We show that Amphipysin 2 (BIN1) is important for N-WASP recruitment which itself activates the Arp2/3 complex to induce actin polymerization. This cascade is important for nuclear movement to the periphery and transversal triad formation. This pathway is perturbed in certain patients harboring BIN1 mutations as it leads to mis-localized amphiphysin 2. Despite originating from the same pathway, peripheral nuclear movement and transversal triad formation are independent processes. An Arp2/3 complex containing Arpc5L together with γ-actin organize desmin to cross-link and zip myofibrils for nuclear movement whereas an Arp2/3 complex containing Arpc5 together with β-actin is required for transversal triad formation.

Les maladies neuromusculaires sont des maladies souvent très sévères et très handicapantes, et un fardeau pour les patients, leurs familles, ainsi que pour le système de santé. Le but de ce projet était de mettre au point et de valider une approche de capture de séquence et de séquençage haut débit pour identifier les mutations en cause chez les patients atteints de maladies neuromusculaires et également trouver les nouveaux gènes qui sont impliqués dans une sous-classe de myopathies, les myopathies centronucléaires. Nous avons montré que l’approche de capture de séquence et de séquençage haut débit peux être utile dans le domaine des maladies neuromusculaires car elle est moins coûteuse que les approches conventionnelles « gène par gène » mise en oeuvre dans les laboratoires de diagnostics génétiques.Cette stratégie devrait élargir les spectres cliniques connus et identifier de nouvelles maladies alléliques (des mutations dans un gène causant différentes maladies). De plus, cela sera utile pour l’élargissement des connaissances sur les corrélations génotypes-phénotypes qui sont nécessaires à une prise en charge plus adaptée et au développement de stratégies thérapeutiques. / Neuromuscular disorders (NMD) are genetic diseases affecting muscles, nerves and neuromuscular junctions. They are rare and often severe with different age of onset from childhood to adulthood with significant burden to the patients, their families and public health system. For testing the possibility of using massively parallel sequencing as a routine technique in molecular diagnosis of neuromuscular disorders, the first aim of my PhD project was to use massively parallel sequencing technique in patients with different NMDs for disease-causing mutation detection. The second aim of my PhD project was to find novel gene(s) implicated in centronuclear myopathies (CNM). CNM are inherited neuromuscular disorders and a type of congenital myopathies, characterized mainly by presence of central and one or more internalized nuclei in muscle fibers with different severities and age of onset, using massively parallel sequencing. About 20% of CNM patients don’t have any mutations in four implicated genes. Disease- causing mutation(s)/ gene(s) in these patients need to be identified. We could show that next generation sequencing is a robust technique for gene identification if a homogenous cohort of patients is available and also is useful to use as a routine technique in molecular diagnosis as it istime and cost effective technique.

La myopathie myotubulaire est une maladie musculaire congénitale très sévère. Le laboratoire d’accueil a démontré que les échantillons de muscle de patients atteints de cette maladie ainsi que le modèle murin présentent une surexpression de DNM2, alors que sa réduction par croisement génétique améliore les signes cliniques et histologiques de la maladie. Le but de ce travail consistait à développer, tester et valider des composés injectables qui ciblent DNM2 et diminuent son niveau. Deux approches thérapeutiques ont été développées l’une basée sur l’utilisation de virus adéno-associés (AAV) exprimant des shRNA, l’autre sur les oligonucleotides antisens (ASO). L’injection des vecteurs AAV-shDnm2 ou bien les ASO-Dnm2 pouvait corriger les défauts histologiques et fonctionnels des muscles des souris myopathes.Les résultats obtenus montrent le potentiel thérapeutique de la réduction de DNM2, et présente une nouvelle approche pour le traitement de la myopathie myotubulaire. / Myotubular myopathy is a severe muscle disease. We previously have shown that muscle specimens of both patients and the mouse model presented an overexpression of DNM2, while its genetic reduction prevents the development of the muscle phenotypes. The aim of this work was to develop, test and validate deliverable compounds. Two therapeutic approaches were used. Injection of antisense oligonucleotide or adeno-associated virus expressing shRNA restores a normal lifespan with improved muscle structure and function of the myopathic mice. These results demonstrate that therapeutic potential of reduction of DNM2 level and provides an attractive therapeutic strategy that could be applied to treat myotubular myopathy.

Les myopathies centro-nucléaires (CNM) sont un groupe de maladies musculaires sévères caractérisées par une faiblesse musculaire générale. La forme la plus sévère est la CNM liée à l’X (XLCNM), causée par des mutations de la Myotubularine (MTM1). D’autres formes autosomales existent et sont causées par des mutations de l’Amphiphysine2 (BIN1) et de la Dynamine2 (DNM2). Les mécanismes pathologiques menant aux CNMs restent à éclaircir et à ce jour aucune thérapie n’est disponible pour traiter les patients. Nous avons modulé les niveaux de protéines de MTM1, BIN1 et DNM2 dans des modèles murins de CNMs. Nous avons découvert que la sous-régulation de DNM2 sauvait le modèle murin de XLCNM et que la sur-expression de la protéine BIN1 humaine sauvait le modèle murin XLCNM ainsi que la forme autosomale causée par les mutations DNM2. Nous avons montré que MTM1 contrôlait l’adhésion cellulaire et le recyclage de l’intégrine dans les cellules musculaires. Nous avons observé que la sur-expression de BIN1 sauvait la dérégulation du recyclage de l’intégrine dans le modèle murin de XLCNM, ce qui suggère un lien fonctionnel entre BIN1 et MTM1 nécessaire pour l’adhésion focale au niveaux musculaire. Notre étude montre que MTM1, BIN1 et DNM2 participe à une voie de signalisation commune et que BIN1 et DNM2 représentent de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des CNM. / Centronuclear myopathies (CNM) are a group of severe muscle disorder characterized by general muscle weakness. The most severe form is the X-linked CNM (XLCNM), caused by mutations in Myotubularin (MTM1). Others autosomal forms are caused by mutations in Amphiphysin 2 (BIN1) and Dynamin 2 (DNM2). The CNM pathomechanisms are still unclear and to date there are no therapies available to the disease. To investigate the pathways dysregulated in CNM and to identify new therapeutic strategies, we modulated MTM1, BIN1 and DNM2 protein levels in the CNM mouse models. We discovered that DNM2 downregulation rescued the XLCNM mouse model and that the overexpression of human BIN1 rescued the XLCNM and the autosomal dominant CNM form due to DNM2 mutations. We have also showed that MTM1 controls cell adhesion and integrin recycling in mammalian skeletal muscle and BIN1 overexpression rescued the integrin recycling alteration in XLCNM mouse model suggesting that MTM1 and BIN1 are functionally linked and necessary for focal adhesions in muscle. Therefore, our studies highlight that MTM1, BIN1 and DNM2 are in a common pathway and, BIN1 and DNM2 could be new therapeutic targets to treat the different CNM forms.