Les microglies sont les principales cellules neuro-immunitaires du cerveau, jouant un rôle important à la fois dans l'homéostasie cérébrale et les états pathologiques. Outre la sécrétion de molécules pro-inflammatoires et anti-inflammatoires, elles participent également au remodelage des circuits neuronaux par des mécanismes qui incluent l'élagage (« pruning ») synaptique, l'effeuillage (« stripping ») synaptique et la maturation synaptique. Ainsi, la microglie est connue pour ses divers rôles dans différentes conditions physiologiques et pathologiques, selon le microenvironnement dans lequel elle se trouve et du contexte qui module ses activités. La grande diversité des fonctions microgliales résulterait de la nature hétérogène de la population microgliale, ce qui signifie que toutes les cellules microgliales ne sont pas identiques et peuvent présenter des différences dans leurs modes d'action. Cette hétérogénéité microgliale a fait l'objet de quelques études dans différentes conditions physiologiques et pathologiques. En 2016, j'ai observé et publié des travaux décrivant la présence d'un nouveau phénotype microglial dans le cerveau, les microglies « sombres », lors de l'étude des interactions entre les microglies et les synapses en contextes de stress chronique, vieillissement et maladie. En microscopie électronique à transmission, nous avons décrit la présence de cellules semblables aux microglies, mais possédant un cytoplasme et un nucléoplasme denses, une perte du motif d'hétérochromatine nucléaire, ainsi que des marqueurs de stress oxydatif. Nous avons décrit la prévalence accrue de ce type de cellules dans des modèles murins de stress chronique, de la pathologie de la maladie d'Alzheimer, de vieillissement et d'altération de la communication neurone-microglie. En utilisant la microscopie électronique avec immunomarquage pour étudier la colocalisation de la microglie sombre avec différents marqueurs cellulaires, nous avons également démontré l'origine microgliale de la microglie sombre et identifié grâce aux données d'ultrastructure un rôle potentiel dans le remodelage synaptique. Nous avons également caractérisé la présence des microglies sombres pendant les stades postnatal du neurodéveloppement normal et proposé un rôle potentiel dans le remodelage synaptique au cours de mécanismes développementaux, en particulier l'affinement et la maturation des circuits neuronaux. Ma thèse décrit donc la microglie sombre comme un nouveau phénotype de la microglie présentement observé en utilisant des outils de microscopie électronique. Selon les évidences ultrastructurelles que nous avons obtenues, les microglies sombres pourraient être un sous type de microglies principalement impliqué dans le remodelage synaptique, en vue d'adapter le cerveau en condition pathologique ou en réponse à des changements de l'environnement externe. Elles pourraient également être un type cellulaire important, impliqué avec les microglies normales dans la sculpture et l'affinement des circuits neuronaux au cours du développement cérébral postnatal, par l'élimination des contacts synaptiques superflus. Nous soulignons donc l'importance d'étudier la microglie sombre la nécessité d'identifier des marqueurs spécifiques à la microglie sombre pour faciliter l'isolement et la caractérisation moléculaire de ces cellules afin de concevoir éventuellement des traitements utilisant l'activité de ces cellules pour traiter divers troubles neurologiques. / Microglia are the principle neuroimmune cells of the brain, having important roles both in brain homeostasis as well as pathological states. Apart from the secretion of pro-inflammatory or anti-inflammatory molecules, they also participate directly at the synaptic level in the remodeling of neuronal circuitries by remodeling mechanisms that include synaptic pruning, synaptic stripping, and synaptic maturation. Thus microglia are known to display diverse roles in different physiological and pathological conditions, largely depending upon the microenvironment they are present in and the context that triggers their activities. One reason for microglia displaying such diverse roles was hypothesized to be the heterogeneous nature of the microglial population, meaning that all microglial cells are not alike and may display differences in their modes of action. For a long time researchers have thus focused on studying this microglial heterogeneity in a number of physiological and pathological states. In 2016, I reported the presence of a novel microglial phenotype in the brain, named the "dark" microglia, while studying microglia-synapse interactions in the contexts of chronic stress, aging, and disease. Using transmission electron microscopy, we described the presence of a microglia-look alike cell, but with a dense cytoplasm and nucleoplasm, as well as loss of nuclear heterochromatin pattern and signs of oxidative stress. We described the increased prevalence of this cell type in mouse models of chronic stress, Alzheimer's disease pathology, aging, and neuron-microglia communication alteration. Using immunoelectron microscopy to study the colocalization of dark microglia with different cell type markers, we further demonstrated the microglial origin of the dark microglia, as well as proposed putative synaptic remodeling roles based on our observations of extensive dark microglia-synapse interactions captured at the ultrastructural level. We have also characterized the presence of dark microglia in postnatal stages of early brain development. Our findings suggested synaptic remodeling roles during normal development, especially in the refinement and maturation of the neuronal circuitry, as well as phagocytosis of apoptotic cells. My thesis thus describes dark microglia as a new microglial phenotype currently seen using electron microscopy (EM) tools. Based on the ultrastructural evidence we have, the dark microglia could represent an important microglial subtype that is primarily involved in synaptic remodeling in an attempt to bring about adaptation of the brain in response to disease or changes in external environment. They could also be an important cell type along with typical microglia that mediates the sculpting and refinement of the neuronal circuitry during early postnatal brain development, when there is an excess of synaptic contacts being formed that need to be pruned out. We therefore highlight the importance of studying the dark microglia, and the need of identifying dark microglia-specific markers to aid with the isolation and further molecular characterization of these cells, to eventually develop therapeutics that utilize the activity of these cells to treat various neurological disorders.

Un des aspects les plus marquants de l'évolution des grands singes est l'augmentation relative du volume du cerveau, et en particulier du néocortex, qui culmine chez Homo sapiens. La microcéphalie primaire est une anomalie congénitale du développement cérébral humain caractérisée par un cerveau normalement formé mais de petit volume. Il en existe une forme isolée, non syndromique, dont la majorité des cas sont d'origine génétique et transmis sur le mode autosomique récessif (MCPH), qui constituent donc un modèle génétiquement simple qui résulte de l'altération d'un seul gène, essentiel dans le développement volumique du cerveau. Une consanguinité parentale est présente dans la majorité des cas, ce qui permet une approche puissante de localisation génomique de la mutation responsable, nommée cartographie d'homozygotie. A ce jour, huit gènes causant cette anomalie ont déjà été identifiés :BRIT1 (MCPH1), ASPM (MCPH5), CDK5RAP2 (MCPH3) et CENPJ (MCPH6), et plus récemment, STIL (MCPH7), CEP152 (MCPH9), WDR62 (MCPH2) et CEP135 (MCPH8). Tous ces gènes jouent un rôle au niveau du cycle cellulaire. Nous avons tenté, au cours de ce doctorat, d’identifier et de caractériser un nouveau gène du locus MCPH4 cartographié au laboratoire et situé sur le bras long du chromosome 15. <p>Dans trois familles MCPH4 originaires de villages voisins du Maroc rural, nous avons affiné la zone de liaison à un segment de 3,7cM, contenant un haplotype commun sur une longueur de 2,7cM suggérant un déséquilibre de liaison autour d’une mutation ancestrale. Le LOD score combiné dans les trois familles était supérieur à 6. Parmi les gènes contenus dans cette région, nous avons sélectionné des candidats que nous avons ensuite analysés par séquençage direct de l’ADN de nos patients. Parmi ces gènes, CASC5 présentait un variant, homozygote chez nos patients, hétérozygote chez leurs parents sains et absent chez 150 contrôles non apparentés. Nous avons utilisé la technologie 454 de séquençage à haut débit de Roche pour séquencer les gènes de l’intervalle de 2.7Mb en une fois. Parmi les mutations identifiées, nous n’avons trouvé qu’une seule variation exonique inconnue qui correspondait à la variation faux-sens déjà identifiée dans le gène CASC5. CASC5 est une protéine centromérique requise pour l’alignement des chromosomes à la métaphase et pour le point de contrôle métaphasique de la progression mitotique. Il était donc potentiellement un très bon candidat causal de la microcéphalie primaire. CASC5 lie directement MIS12, BUB1, BUBR1 et Zwint-1, et fait partie du réseau KMN du kinétochore. Il est nécessaire à l’ancrage des centromères chromosomiques au fuseau mitotique, et est requis pour le contrôle du cycle cellulaire au niveau du Spindle-Assembly Checkpoint.<p>Nous avons ensuite confirmé que la mutation génère un défaut d’épissage chez nos patients consistant en la perte partielle de l’exon 18 dans l’ARNm. La perte de cet exon conduit à un déphasage du cadre de lecture provoquant l’apparition d’un codon STOP prématuré dans l’exon 19. Ceci prédit donc la formation d’une protéine tronquée, ou absente après dégradation par le mécanisme cellulaire de dégradation des ARNm non-sens. Par Western-Blotting nous avons pu révéler, en lignée lymphoblastoïdes, la protéine CASC5 endogène chez tous nos patients, y compris, à notre surprise, chez les sujets atteints. <p>Il est décrit dans la littérature qu’un knockdown de CASC5 provoque un mauvais alignement des chromosomes, une entrée prématurée en mitose et la formation de micronoyaux, conséquence d’un mauvais alignement des chromosomes pendant la métaphase. Les différentes études menées sur le phénotype cellulaire de nos patients en lignées lymphoblastoïdes n’ont pu révéler ces défauts. Notre hypothèse est que l’allèle muté est hypomorphe et que le phénotype cellulaire décrit en boites de culture ne s’observerait in vivo que dans certaines cellules du cerveau en cours de développement.<p>En parallèle de ces travaux, nous avons également contribué à l’identification de la cause d’une microcéphalie primaire syndromique, associée à un diabète insulino-requérant précoce, tansmis sur le mode récessif autosomique et identifié dans une famille d’origine marocaine. Notre laboratoire avait localisé la mutation dans une région de 3 cM du chromosome 4. Parmi les 39 gènes compris dans cette région, nous en avons sélectionné et séquencé plusieurs. Aucun n’a cependant montré de mutation. Un séquençage de l'exome complet de l’un de nos patients, a permis de mettre en évidence une mutation non-sens homozygote dans un gène de l’intervalle critique de liaison. La mutation ségrège avec le phénotype autosomique récessif chez les malades, leurs parents et leurs germains asymptomatiques. L’abondance du transcrit de ce gène a été mesurée en lignées lymphoblastoïdes de patients :il est présent en quantité similaire chez les patients et chez un contrôle non apparenté. <p>En conclusion, notre travail a permis l’identification d’un nouveau gène muté chez des patients atteints de microcéphalie primaire, CASC5, avec un haut degré de preuve de causalité de cette mutation, impliquant ainsi une protéine du réseau KMN du kinétochore dans le développement volumique du cerveau humain. Nous avons par ailleurs contribué à l’identification d’un nouveau gène causant microcéphalie primaire et diabète juvénile, dont le mécanisme biologique est en cours d’investigation.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished