Des mutations dans le gène doublecortine (DCX) sont responsables de lissencéphalie de type 1 ou d'hétérotopie laminaire sous-corticale. Les souris invalidées pour le gène Dcx sont épileptiques et présentent des anomalies hippocampiques, avec notamment la présence de deux couches de cellules pyramidales spécifiquement dans l'aire CA3 de cette structure. Cette hétérotopie hippocampique est associée à une hyperexcitabilité. Notre but est d'identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de cette hyperexcitabilité chez les souris Dcx. Pendant ma thèse, j'ai pu isoler les neurones mal-positionnés de la région CA3 de l'hippocampe, afin de comparer leurs profils d'expression génique à ceux des neurones de la région CA3 des souris contrôles. Les résultats au stade P0 (jour de la naissance des souris), montrent que les profils d'expression génique de chacune des deux couches hétérotopiques présentes chez les souris Dcx, diffèrent entre eux ainsi qu'en comparaison avec les profils de la couche pyramidale des contrôles. Sur le plan fonctionnel, cette étude indique des perturbations au niveau des organelles intracellulaires, tels que les mitochondries et l'appareil de Golgi. En étudiant séparément les profils associés à chacune des deux couches des souris Dcx, nous avons mis en évidence des différences de degrés de maturité neuronale entre chacune des couches. L'utilisation de marqueurs moléculaires spécifiques aux couches en combinaison avec des expériences d'injections de bromo-désoxy-uridine (BrdU) une inversion des couches neuronales présentes chez les mutants. En complément des données d'expression génique, des analyses morphologiques et ultrastructurales indiquent que les cellules hétérotopiques, présentent des anomalies d'organelles intracellulaires, avec notamment des défauts de mitochondries et des modifications de l'appareil de Golgi. Qui plus est, nos données montrent une augmentation significative de la mort cellulaire dans les régions CA1 et CA3 de l'hippocampe. Aussi, nous avons également montré que les couches hétérotopiques étaient hétérogènes, présentant notamment des distributions anormales des précurseurs d'oligodendrocytes et des interneurones exprimant la somatostatine. Ces résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives pour mieux comprendre la physiopathologie de ces maladies graves associées à des hétérotopies neuronales dans le cerveau, de l'épilepsie et des déficits cognitifs

Les progrès médicaux de la prise en charge des nouveau-nés prématurés ont permis la diminution de la mortalité néonatale, mais la prévalence des handicaps neurologiques d'origine périnatale reste stable. Ainsi, la mise en place de stratégies de neuroprotection est un enjeu primordial de la médecine périnatale actuelle. Parmi ces stratégies, l'administration de sulfate de magnésium en cas de menace d'accouchement prématuré permet l'amélioration du devenir neurologique des enfants à l'âge de deux ans. La neuroprotection concerne aussi l'ensemble des interventions qui ont lieu après la naissance, pendant la période néonatale. Depuis les années 2000, les agents anesthésiques sont mis en cause dans la survenue d'anomalies du développement lorsqu'ils sont administrés chez le nouveau-né. La balance bénéfice/risque doit donc être évaluée pour chaque anesthésique prescrit en période néonatale afin de limiter une potentielle neurotoxicité. La première partie de cette thèse a pour objectif le suivi à l'âge scolaire d'une cohorte d'enfants prématurés exposés en anténatal au sulfate de magnésium. La deuxième partie est consacrée à l'évaluation in vivo de l'impact du rémifentanil, morphinique de synthèse utilisé comme agent anesthésique, sur le cerveau immature du souriceau en condition excitotoxique. 1 - Etude de l'influence de l'administration anténatale du sulfate de magnésium sur le développement psychomoteur à l'âge scolaire de prématurés de moins de 33 semaines d'aménorrhée : essai Premag. L'étude Premag, débutée en France en 1997, avait permis l'inclusion de 688 nouveau-nés prématurés exposés au sulfate de magnésium ou à un placebo, dont 606 ont été suivis à l'âge de deux ans. Un suivi à plus long terme était nécessaire pour affirmer l'innocuité de la molécule sur le devenir neurocognitif à l'âge scolaire. Entre 'décembre 2009 et avril 2012, les familles qui avaient participé à l'essai Premag ont été recontactées. Quatre-cent-trente-et-un enfants (moyenne d'âge 11 ans) parmi les 606 survivants ont été évalués à l'âge scolaire par un questionnaire parental. Le critère d'évaluation principal était un critère combiné déficit moteur et/ou décès. Il n'a pas été mis en évidence d'effet délétère de l'exposition anténatale au sulfate de magnésium. Par ailleurs, une diminution non significative des troubles du comportement, une meilleure scolarisation et une réduction du recours aux services d'éducation à domicile ont été observées en cas d'exposition au sulfate de magnésium. 2 - Effet neuroprotecteur du rémifentanil dans un modèle murin de lésion excitotoxique néonatale. Le rémifentanil, morphinique de synthèse, est utilisé en période périnatale, chez la mère en cas d'anesthésie générale ou chez le nouveau-né en cas de nécessité d'anesthésie/analgésie. Nous avons évalué in vivo l'impact du morphinique en contexte lésionnel. Les lésions cérébrales ont été obtenues par administration intracorticale d'iboténate, agoniste glutamatergique, au deuxième jour de vie (P2) chez le souriceau. Après exposition au rémifentanil, la taille de la lésion induite par l'iboténate était significativement réduite à P7. Cet effet protecteur était accompagné par une diminution de la production des dérivés réactifs de l'oxygène et de l'astrogliose réactionnelle, suggérant un effet modulateur de la neuroinflammation par le rémifentanil. L'activité caspase était également réduite dans le groupe rémifentanil. Enfin, les performances sensori-motrices (géotaxie négative entre P6 et P8 et réflexe d'agrippement entre P10 et P12) étaient améliorées chez les animaux lésés exposés au morphinique. A P18, l'analyse du comportement des souris dans l'open field semblait suggérer que l'exposition au rémifentanil à P2 entraînait un effet anxiolytique, particulièrement chez les femelles. / Better protecting the developing brain of very preterm infants remains a dailychallenge for all specialists in perinatal care. Despite improvement of neonatal mortality andmorbidity, very preterm infants remain vulnerable and at risk of developing neurologicalimpairments. To limit the occurrence of such events, implementing of neuroprotectionduring brain development is essential. Neuroprotection in the context of preterm birth is thesubject of extensive research, but few strategies have currently been demonstrated to beeffective. One part of these strategies takes place before birth, as antenatal corticosteroidsadministration that is known to reduce intraventricular hemorrhage, or in utero transfer totertiary maternity hospitals. There is now strong evidence to support antenatal magnesiumsulfate infusion in order to prevent cerebral palsy in context of prematurity.Neuroprotection may also occur after birth and evaluate the benefit/risk balance for eachpotentially deleterious drug administered during this period, such as anesthetics, is one ofthose strategies. Fetuses and preterm newborns are exposed to general anesthesia duringcesarean delivery or in neonatal intensive care when sedation and analgesia isrecommended. The role of these agents remains extremely controversial and could appearto be neurotoxic.This thesis work is part of the development and evaluation of neuroprotectionstrategies for preterm neonates. The first part aims at the follow up of the French PREMAGcohort to evaluate the children for any long-term deleterious effects of magnesium sulfate,and to assess developmental and psychomotor outcomes at school-age. The second part isdevoted to the evaluation of the in vivo impact of remifentanil, synthetic opiate, on theimmature brain of mouse pups in an excitotoxic condition.

L’inhalation de monoxyde d’azote (NO) est l’une des thérapies les plus utilisées en réanimation néonatale. Cependant, peu de données sont disponibles sur l’impact de l’inhalation de NO sur le développement cérébral et le devenir des enfants prématurés. Nous avons étudié l’impact du monoxyde d’azote inhalé (iNO) sur le cerveau en développement chez le rongeur. Des portées et leur mère sont placés sous 5 à 20 ppm de NO de la naissance (P0) jusqu’au 7ème jour de vie postnatal (P7). Les animaux exposés au NO présentent une augmentation transitoire de l’angiogenèse et de la myélinisation, sans incidence sur les fonctions cognitives à l’âge adulte. L’exposition au NO est associée à une prolifération d’oligodendrocytes immatures et à une maturation anticipée des formes myélinisantes. Les rôles du NO endogène et du couple VEGF/VEGFR2 dans ces effets ont été évalués via l’injection d’antagonistes : LNAME pour inhiber les NOS, SU-5416 comme antagoniste du VEGFR2. Dans les deux cas, l’inhalation de NO corrige les anomalies de myélinisation et d’angiogenèse induites par ces inhibiteurs. Nous avons soumis des ratons à une agression excitotoxique par injection intracérébrale d’agonistes du glutamate. A P10 les rats exposés au iNO avant l’injection présentent des lésions moins importantes ; ainsi qu’un diminution de densité des microglies activées et des astrocytes. Cet effet neuroprotecteur est associé à une régulation de sous-unités des récepteurs au glutamate dès P5. Cet effet transcriptionnel semble lié à la modulation de la signalisation pCREB/Akt. Les effets à distance du iNO sont liés à un transport réversible endovasculaire du NO. In fine, du NO est delivré à la cellule et les concentrations intracellaires de cGMP augmentent d’un facteur 5. Plusieurs facteurs de transcription sont régulés : PDGFR-α, Sema3F, les sous-unités des récepteurs au glutamate, Thrombospondine-1. Cette dernière est un antagoniste naturel de la signalisation NO-cGMP. L’injection de ABT-510, agoniste de TSP-1, abolit les effets du iNO, confirmant l’hypothèse que les effets à distance reposent sur la signalisation NO-Guanylate Cyclase soluble-cGMP. Au total, nous avons démontré que le iNO est transporté de manière réversible et delivré au cerveau en développement. Il y exerce un effet pro-angiogénique et pro-myélinisant, via une signalisation cGMP, régulée par la thrombospondine-1. Plus encore, l’exposition prophylactique au iNO diminue l’impact d’une agression excitotoxique. Ce qui augure de propriétés neuroprotectrices prometteuses en néonatalogie, et au delà. / Inhaled nitric oxide (iNO) is one of the most promising therapies used in neonates, but littlei known about its effect on the developing brain. We explored the effects of iNO on developing brain in rodent pups, and pathway involved in iNO remote effects. Rat pups and their mothers were placed in a chamber containing 5 to 20 ppm of NO for 7 days after birth. Extensive serum analysis, immunochemistry, RT-PCR analysis, were performed Neonatal exposure to iNO was associated with a transient increase in central nervous system myelination and angiogenesis in rats, without any behavioral consequences in adulthood. Exposure to iNO was associated with a proliferative effect on immature oligodendrocytes and a subsequent promaturational effect. The role of endogenous NO in myelination was investigated in animals treated with the nitric oxides synthase inhibitor N-nitro-L- arginine methyl ester (L-NAME) in the neonatal period ; this led to protracted myelination defects and subsequent behavioral deficits in adulthood. These effects were reversed by rescuing L-NAME-treated animals with iNO. We challenged animals with intracranial injection of glutamate agonists. At P10, rat pups exposed to iNO exhibited a significant decrease of lesion size in both the white matter and cortical plate compared to controls. Microglia activation and astrogliosis were found significantly decreased in NO-exposed animals. This neuroprotective effect was associated with a significantdecrease of several glutamate receptor subunits expression at P5. iNO was associated with an early(P1) downregulation of pCREB/pAkt expression and induced an increase in pAkt proteinconcentration in response to excitotoxic challenge (P7) Those effects were related to a release of NOto the cells, and a rise of cGMP intracellular concentration. Several transcription factor wereregulated, namely PDGFR-α, Sema3F, TSP-1, glutamate receptors subunits, Thrombospondin-1. Thelatter was responsible for NO pathway regulation, and injection of TSP-1 agonist (AbT-510) abolishediNO remote effects. iNO remote effects are not associated VEGF concentration increase nor VEGFRstimulation, as VEGF-R antagonist SU54-16 failed to abolish iNO effects on angiogenesis andmyelination. Moreover iNO reverses severe myelination and angiogenesis defects induced by this SU-5416. Thus, we demonstrate transport and considerable remote effect of iNO on angiogenesis andmyelination in rodents. Those effects are related to an enhancement of cGMP pathway, regulated byTSP-1, and transcriptional effects. Moreover we described and investigated the neuroprotectiveeffect of iNO in neonatal excitotoxic-induced brain damage. These data point to potential newavenues for neuroprotection in human perinatal brain damage.

L'inhalation de monoxyde d'azote (NO) est l'une des thérapies les plus utilisées en réanimation néonatale. Cependant, peu de données sont disponibles sur l'impact de l'inhalation de NO sur le développement cérébral et le devenir des enfants prématurés. Nous avons étudié l'impact du monoxyde d'azote inhalé (iNO) sur le cerveau en développement chez le rongeur. Des portées et leur mère sont placés sous 5 à 20 ppm de NO de la naissance (P0) jusqu'au 7ème jour de vie postnatal (P7). Les animaux exposés au NO présentent une augmentation transitoire de l'angiogenèse et de la myélinisation, sans incidence sur les fonctions cognitives à l'âge adulte. L'exposition au NO est associée à une prolifération d'oligodendrocytes immatures et à une maturation anticipée des formes myélinisantes. Les rôles du NO endogène et du couple VEGF/VEGFR2 dans ces effets ont été évalués via l'injection d'antagonistes : LNAME pour inhiber les NOS, SU-5416 comme antagoniste du VEGFR2. Dans les deux cas, l'inhalation de NO corrige les anomalies de myélinisation et d'angiogenèse induites par ces inhibiteurs. Nous avons soumis des ratons à une agression excitotoxique par injection intracérébrale d'agonistes du glutamate. A P10 les rats exposés au iNO avant l'injection présentent des lésions moins importantes ; ainsi qu'un diminution de densité des microglies activées et des astrocytes. Cet effet neuroprotecteur est associé à une régulation de sous-unités des récepteurs au glutamate dès P5. Cet effet transcriptionnel semble lié à la modulation de la signalisation pCREB/Akt. Les effets à distance du iNO sont liés à un transport réversible endovasculaire du NO. In fine, du NO est delivré à la cellule et les concentrations intracellaires de cGMP augmentent d'un facteur 5. Plusieurs facteurs de transcription sont régulés : PDGFR-α, Sema3F, les sous-unités des récepteurs au glutamate, Thrombospondine-1. Cette dernière est un antagoniste naturel de la signalisation NO-cGMP. L'injection de ABT-510, agoniste de TSP-1, abolit les effets du iNO, confirmant l'hypothèse que les effets à distance reposent sur la signalisation NO-Guanylate Cyclase soluble-cGMP. Au total, nous avons démontré que le iNO est transporté de manière réversible et delivré au cerveau en développement. Il y exerce un effet pro-angiogénique et pro-myélinisant, via une signalisation cGMP, régulée par la thrombospondine-1. Plus encore, l'exposition prophylactique au iNO diminue l'impact d'une agression excitotoxique. Ce qui augure de propriétés neuroprotectrices prometteuses en néonatalogie, et au delà.