Die Charcot-Marie-Tooth-Neuropathie umfasst eine heterogene Gruppe von erblichen unter anderem demyelinisierenden Erkrankungen des peripheren Nervensystems. Trotz ihrer hohen Prävalenz von 1:2.500 gibt es bis dato keine kausalen Therapiemöglichkeiten. Durch den progressiven Krankheitsverlauf wird die Lebensqualität der Patienten stetig gemindert; der fortschreitende Verlust der Muskelkraft und Störungen des Gangbildes sind besonders belastend. Ursächlich für die CMT1-Neuropathie sind unter anderem Mutationen in Genen, die für Moleküle des Myelins von Schwannzellen codieren. Diese Mutationen führen zu einer verminderten Stabilität und Funktion des Myelins und so letzten Endes zu einer Demyelinisierung und axonalen Schädigung der peripheren Nerven. Weitere Studien in CMT1-Mausmodellen zeigten jedoch, dass nicht nur die verringerte Myelinstabilität sondern auch eine durch das Immunsystem vermittelte geringgradige Entzündungsreaktion für die Symptome ursächlich sein könnte. Hier spielen vor allem Makrophagen eine zentrale Rolle. Das Zytokin CSF-1 aktiviert die Makrophagen und verursacht so eine Demyelinisierung der peripheren Nerven. In P0het und Cx32def Mausmodellen konnte nachgewiesen werden, dass eine medikamentöse Inhibition des CSF-1-Rezeptors an Makrophagen zu einem verbesserten Nervphänotypen und einer deutlichen Abmilderung des Krankheitsbildes führte. In dieser Arbeit wurden in P0het und Cx32def Mausmodellen weiterführende Behandlungsstudien mit einem CSF-1-RI durchgeführt, die untersuchen, zu welchem Zeitpunkt innerhalb des Krankheitsverlaufs (therapeutisch oder präventiv) eine erfolgreiche Therapie noch möglich ist und ob bei einem früheren Beginn eine noch bessere Wirkung erzielt werden kann. Abhängig von den verschiedenen Start- und Endpunkten waren unterschiedliche Ergebnisse zu beobachten: Hinsichtlich der klinischen Parameter wie der Greifkraft und der Anzahl an abnormal innervierten Synapsen zeigten die Tiere im präventiven Behandlungszweig in beiden Mausmodellen das beste Ergebnis im Vergleich zu den Kontrolltieren. Diese substantielle Verbesserung ließ sich unabhängig von einem Makrophagen-Reflux sogar noch 6 Monate nach Behandlungsabbruch nachweisen. Bezüglich der endoneuralen Makrophagendepletion war sowohl in den P0het als auch den Cx32def Tieren im präventiven sowie im therapeutischen Behandlungszweig eine signifikante Verbesserung zu beobachten. Diese Ergebnisse heben ein weiteres Mal die Bedeutung der Makrophagen als Teil einer Entzündungsreaktion in der Pathogenese der CMT1-Neuropathie hervor. Des Weiteren konnte die These gefestigt werden, dass eine Inhibition des CSF-1-Rezeptors zu verbesserten histopathologischen sowie funktionellen Parametern führt. Um ein gutes Ansprechen auf die Therapie zu erzielen, müssen ein möglichst früher Therapiebeginn sowie eine nachhaltige Behandlungsdauer gewährleistet sein. / "Macrophage-mediated inflamma3on is a potent driver of disease progression in mouse models of Charcot-Marie-Tooth (CMT) 1 diseases. This leads to the possibility to consider these cells as therapeu3c targets to dampen disease outcome in the so far non-treatable neuropathies. As a pharmacological proof-of-principle study, long-term targe3ng of nerve macrophages with the orally applied CSF-1 receptor specific kinase (c-FMS) inhibitor PLX5622 showed a substan3al allevia3on of the neuropathy in dis3nct CMT1 mouse models. However, regarding transla3onal op3ons, clinically relevant ques3ons emerged regarding treatment onset, dura3on and termina3on. Corrobora3ng previous data, we here show that in a model for CMT1B, peripheral neuropathy was substan3ally alleviated aQer early con3nuous PLX5622 treatment in CMT1B mice, leading to preserved motor func3on. However, late-onset treatment failed to mi3gate histopathological and clinical features, despite a similar reduc3on in the number of macrophages. Surprisingly, in CMT1B mice, termina3ng early PLX5622 treatment at six months was s3ll sufficient to preserve motor func3on at 12 months of age, sugges3ng a long-las3ng, therapeu3c effect of early macrophage deple3on. This novel and unexpected finding may have important transla3onal implica3ons, since we here show that con3nuous macrophage targe3ng appears not to be necessary for disease allevia3on, provided that the treatment starts within an early, cri3cal 3me window.” (Ostertag et al., Experimental Neurology, 2022)

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in dt. Sprache.

Charcot-Marie-Tooth (CMT) type 1 neuropathies are a genetically heterogeneous group of non-treatable inherited disorders affecting the peripheral nervous system that lead to sensory and motor dysfunction. Secondary low grade inflammation, implicating the innate and adaptive immune system, could previously be identified as a substantial disease modifier in two mouse models for CMT1, CMT1B and 1X, respectively. However, the exact mechanism how the adaptive immune system contributes to disease pathogenesis is not completely understood. Based on observations that the accumulation of endogenous antibodies to myelin components is important for rapid myelin clearance after nerve injury during Wallerian degeneration, a possibly similar mechanism was considered for endogenous antibodies as disease amplifier in mice heterozygously deficient for P0 (P0het), mimicking some typical features of CMT1B. In this study an increased antibody deposition was detected in the affected peripheral nerves of P0het myelin mutant mice. By crossbreeding P0het mutants with mice specifically lacking B-lymphocytes, and therefore antibodies (JHD-/-), a decline of endoneurial macrophages together with a substantially ameliorated demyelination could be demonstrated in 6-month-old mutant mice. Moreover, reconstitution with murine IgGs reverted the neuropathic phenotype, substantiating that endogenous antibodies are potentially pathogenic at this early stage of disease. Unexpectedly, in 12-months-old P0het mutants, JHD deficiency resulted in disease aggravation accompanied by an increased inflammatory reaction and M2-polarized macrophage response. These observations suggest that in a mouse model for CMT1B, the lack of endogenous antibodies has a dichotomous effect: ameliorating early macrophage-mediated demyelination, as opposed to increasing inflammatory reactions leading to disease aggravation at older ages. / Als Charcot-Marie-Tooth (CMT) Typ 1 Erkrankungen bezeichnet man eine genetisch heterogene Gruppe von nicht behandelbaren, erblichen Neuropathien, die das periphere Nervensystem betreffen und letztendlich zu starken motorischen und sensorischen Defiziten führen. Anhand verschiedener Studien konnte gezeigt werden, dass sekundäre Entzündungsreaktionen, insbesondere des angeborenen und adaptiven Immunsystems, eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von zwei verschiedenen CMT1-Mausmodellen (CMT1B und CMT1X) spielen. Jedoch ist der genaue Mechanismus, in dem das adaptive Immunsystem zur Pathogenese beiträgt, nicht komplett bekannt. In einer veröffentlichten Studie wurden gebundenen endogenen Antiköpern eine wichtige Rolle beim raschen Myelinabbau nach Nervläsion während der Waller´schen Degeneration zugeschrieben. In Mäusen, die heterozygot defizient für P0 (P0het) sind und einige typische Merkmale der CMT1B Neuropathie aufweisen, sollte ein möglicherweise ähnlicher Mechanismus von endogenen Antikörpern untersucht werden, der zur Verstärkung der Krankheitsentwicklung führt. In dieser Studie konnte eine vermehrte Antikörperbindung in den betroffenen peripheren Nerven von P0het Myelinmutanten beobachtet werden. Anhand von Verkreuzungs-Experimenten von P0het Mutanten mit Mäusen, die keine B-Lymphozyten besitzen und daher keine Antikörper bilden können (JHD-/-), konnte zudem in den untersuchten 6 Monate alten Doppelmutanten eine verringerte Anzahl endoneuraler Makrophagen und eine deutliche Verbesserung der Demyelinisierung aufgezeigt werden. Zusätzlich konnte anhand von Rekonstitutions-Experimenten mit mausspezifischen-IgGs der neuropathische Phänotyp in peripheren Nerven wiederhergestellt werden, was die mögliche pathogenetische Rolle endogener Antikörper im frühen Stadium der Erkrankung bekräftigt. Unerwarteterweise führte die JHD-Defizienz jedoch in 12 Monate alten P0het Mausmutanten eher zu einer Verschlechterung der Neuropathie, zusammen mit einer verstärkten Entzündungsreaktion und M2-polarisierten Makrophagen-Aktivierung. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass das Fehlen von Antikörpern in einem etablierten Mausmodell für CMT1B unterschiedliche Folgen hat, da dies zu einer verringerten Makrophagen-vermittelten Demyelinisierung im frühen Erkrankungsverlauf führt, gleichzeitig aber im späteren Alter in einer verstärkten Entzündungsreaktion und einem vermehrten Nervschaden resultiert.

Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2007

Zsfassung in dt. Sprache. - Würzburg, Univ., Diss., 2008.

Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2007.

Charcot-Marie-Tooth 1B (CMT1B) is a progressive inherited demyelinating disease of human peripheral nervous system leading to sensory and/or motor function disability and is caused by mutations in the P0 gene. Mice heterozygously deficient for P0 (P0+/-) are an adequate model of this human disorder showing myelin degeneration, formation of onion bulbs, remyelination and a reduced motor conduction velocity of around 30m/s similar to patients. Previously, it had been shown that T-lymphocytes and macrophages play a crucial role during pathogenesis in peripheral nerves of P0+/- mice. Both, T-lymphocytes and macrophages increase in number in the endoneurium and deletion of T-lymphocytes or deletion of a macrophage-directed cytokine ameliorates the disease. In this study the monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) was identified as an early regulated cytokine before onset of disease is visible at the age of six months. MCP-1 mRNA and protein expression could be detected in femoral quadriceps and sciatic nerves of P0+/- mice already at the age of one month but not in cutaneous saphenous nerves which are never affected by the disease. MCP-1 was shown to be expressed by Schwann cells and to mediate the immigration of immune cells into peripheral nerves. Deletion of MCP-1 in P0+/- mice accomplished by crossbreeding P0 and MCP-1 deficient mice revealed a substantial reduction of immune cells in peripheral nerves of P0+/-/MCP-1+/- and P0+/-/MCP-1-/- mice at the age of six months. In twelve months old mice reduction of immune cells in peripheral nerves is accompanied by amelioration of demyelinating disease in P0+/-/MCP-1+/- and aggravation of demyelinating disease in lumbar ventral roots of P0+/ /MCP-1-/- mice in comparison to P0+/ /MCP 1+/+ mice. Furthermore, activation of the MEK1/2-ERK1/2 signalling cascade could be demonstrated to take place in Schwann cells of affected peripheral nerves of P0+/- mice overlapping temporarily and spatially with MCP-1 expression. An animal experiment using a MEK1/2-inhibitor in vivo, CI-1040, revealed that upon reduction of ERK1/2 phosphorylation MCP-1 mRNA expression is diminished suggesting that the activation of the MEK1/2-ERK1/2 signalling cascade is necessary for MCP-1 expression. Additionally, peripheral nerves of P0+/- mice showing reduced ERK1/2 phosphorylation and MCP-1 mRNA expression also show reduced numbers of macrophages in the endoneurium. This study shows a molecular link between a Schwann cell based mutation and immune cell function. Inhibition of the identified signalling cascade might be a putative target for therapeutic approaches. / Die humane Erkrankung Charcot-Marie-Tooth 1B (CMT1B) ist eine erbliche, chronisch fortschreitende Erkrankung des peripheren Nervensystems die durch Mutation des P0-Gens verursacht wird und zu motorischen und/oder sensorischen Defiziten führt. Sehr ähnlich der humanen Erkrankung weist das Mausmodell, eine für das Myelinprotein P0 heterozygot-defiziente Maus (P0+/-), Degeneration peripheren Myelins, aufeinanderfolgende Zyklen von De- und Remyelinisierung als auch reduzierte Nervenleitgeschwindigkeiten auf. Wissenschaftliche Untersuchungen am Mausmodell ergaben eine Beteiligung von T-Lymphozyten und Makrophagen an der Pathogenese. In dieser Studie wurde das Chemokin „Monocyte Chemoattractant Protein-1“ (MCP-1) als pathogen-relevant in P0+/- Mäusen identifiziert. MCP-1 mRNA und Protein wurden sowohl im Alter von sechs und zwölf Monaten nachgewiesen, Stadien, in denen morphologische Veränderungen peripherer Nerven von P0+/- Mäusen zu erkennen sind, aber auch im Alter von einen und drei Monaten, ein Alter bei dem pathologischen Veränderungen nicht zu finden sind. Mit Hilfe von MCP-1 defizienten Mäusen (MCP-1-/-) und Verpaarung mit P0-defizienten Mäusen konnten weiterführende Untersuchungen zur Rolle von MCP-1 im peripheren Nerv der Maus durchgeführt werden. So zeigte es sich mittels Transplantation von GFP-positivem Knochenmark, dass MCP 1 die Infiltration von Makrophagen aus dem Blut in periphere Nerven vermittelt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass periphere Nerven von sechs Monate alten P0+/-/MCP-1+/- und P0+/-/MCP-1-/- Mäusen trotz signifikant niedrigerer Anzahl von Immunzellen keine Milderung der Demyelinisierung zeigen. Hingegen weisen periphere Nerven von zwölf Monate alten P0+/ /MCP-1+/- Mäusen sowohl weniger Makrophagen und T-Lymphozyten als auch wesentlich weniger pathologische Veränderungen auf. Periphere Nerven von P0+/-/MCP-1-/- Tieren dagegen zeigen nur eine nicht signifikante Reduktion von Immunzellen und sogar eine Verschlechterung des Phänotyps im Vergleich zu ventralen Spinalwurzeln von P0+/-/MCP-1+/+ Mäusen. Weiterführende Untersuchungen ergaben, dass eine Aktivierung der MEK1/2-ERK1/2 Signalkaskade sowohl in peripheren Nerven von drei und sechs Monate alten P0+/- Mäusen zu finden ist, allerdings, ähnlich der Expression von MCP-1, nur in peripheren Nerven, die von der Demyelinisierung betroffen sein können. Unter Verwendung eines Inhibitors der Kinasen MEK1 und 2 konnte in vivo gezeigt werden, dass Phosphorylierung von ERK1/2 für die erhöhte MCP-1 Expression in peripheren Nerven von P0+/- Mäusen notwendig ist. Darüber hinaus wurde durch Verminderung der ERK1/2-Phosphorylierung eine Reduktion von Makrophagen im Endoneurium von P0+/- Tieren erzielt.

Charcot-Marie-Tooth (CMT) Neuropathien stellen als häufigste erblich bedingte neurologische Erkrankungen eine Gruppe genetisch heterogener, chronisch progredienter peripherer Polyneuropathien dar. Die Lebensqualität der Patienten ist bei fehlender kurativer Therapieoption vor allem durch motorische und sensorische Defizite deutlich eingeschränkt. In verschiedenen Studien konnte die pathophysiologische Relevanz einer sekundären Entzündungsreaktion, insbesondere durch Makrophagen und Lymphozyten vermittelt, in Mausmodellen dreier CMT1 Subtypen (CMT1A, CMT1B, CMT1X) aufgezeigt werden. Auch in Folge einer Läsion peripherer Nerven ist eine akute Entzündungsreaktion von entscheidender Bedeutung, wobei sich bereits Gemeinsamkeiten zwischen der postläsionalen Waller´schen Degeneration (WD) und CMT1 Neuropathien identifizieren ließen. Während die aktive Beteiligung der Autophagie Schwann´scher Zellen (hier kurz SZ Autophagie genannt) an der Myelindegradation im Falle einer WD jedoch vielfach beschrieben wurde, ist Ähnliches in CMT1 Neuropathien bisher nur unzureichend untersucht. Da in einer Studie in Cx32def Mausmodellen der CMT1X Erkrankung auch nach Reduktion endoneuraler Makrophagen anhaltende Demyelinisierung beobachtet werden konnte, sollte das Vorkommen von SZ Autophagie sowie deren mögliche Beeinflussung durch Makrophagen in diesen Myelinmutanten untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl Wildtyp (Wt) Mäuse in ex vivo und in vivo Modellen einer WD als auch Cx32def Myelinmutanten zweier Altersstufen (4 und 12 Monate) mit einem niedermolekularen CSF1-Rezeptor-Inhibitor (CSF1RI) zur Reduktion endoneuraler Makrophagen behandelt, wobei sich vergleichende histochemische bzw. immunhistochemische Analysen peripherer Nerven behandelter und unbehandelter Tiere anschlossen. Im Rahmen der Etablierung immunhistochemischer Methodik zeigte sich hierbei unter den kontrollierten Bedingungen einer ex vivo Ischiasnervenkultur eine vermehrte Aktivierung der SZ Autophagie in behandelten Wt Mäusen. Auch 4 Monate alte behandelte Cx32def Tiere wiesen, verglichen mit unbehandelten Myelinmutanten bzw. Wt Mäusen derselben Altersstufe, eine vermehrte autophagische Aktivität in SZ auf. Diese scheint sich jedoch im weiteren Verlauf der Erkrankung zu reduzieren, da im Falle der 12 Monate alten Cx32def Modelltiere weniger autophagisch aktive SZ Profile bzw. kaum Unterschiede zwischen behandelten und unbehandelten Tieren beobachtet werden konnten. Die Ergebnisse lassen somit eine mögliche aktive Beteiligung von SZ Autophagie insbesondere in der Pathophysiologie der frühen Phase einer CMT1X Erkrankung sowie deren Beeinflussung durch endoneurale Makrophagen vermuten. Dies sollte vornehmlich in der Entwicklung von Therapiestrategien der CMT1X bedacht werden, da sich eine frühe Reduktion pathophysiologisch relevanter endoneuraler Makrophagen somit auch nachteilig auf die Myelinintegrität auswirken könnte. / Charcot-Marie-Tooth (CMT) neuropathies are the most common hereditary neurological diseases and represent a group of genetically heterogeneous, chronically progressive peripheral polyneuropathies. In the absence of curative treatment options, patients' quality of life is significantly impaired, primarily due to motor and sensory deficits. Various studies have demonstrated the pathophysiological relevance of a secondary inflammatory reaction, in particular mediated by macrophages and lymphocytes, in mouse models of three CMT1 subtypes (CMT1A, CMT1B, CMT1X). An acute inflammatory reaction is also of crucial importance following a lesion of peripheral nerves, whereby similarities between postlesional Wallerian degeneration (WD) and CMT1 neuropathies have already been identified. However, while the active involvement of Schwann cell autophagy (here referred to as SC autophagy) in myelin degradation in WD has been widely described, a similar involvement in CMT1 neuropathies has been insufficiently studied. Since in a study in Cx32def mouse models of CMT1X disease persistent demyelination could be observed even after reduction of endoneural macrophages, the occurrence of SC autophagy and its possible influence by macrophages in these myelin mutants should be investigated. In the present study, both wild-type (Wt) mice in ex vivo and in vivo models of WD and Cx32def myelin mutants of two ages (4 and 12 months) were treated with a small molecule CSF1 receptor inhibitor (CSF1RI) to reduce endoneural macrophages, followed by comparative histochemical and immunohistochemical analyses of peripheral nerves of treated and untreated animals, respectively. During the establishment of immunohistochemical methods, an increased activation of SC autophagy was shown in treated Wt mice under the controlled conditions of ex vivo sciatic nerve culture. Even 4-month-old treated Cx32def animals showed increased autophagic activity in SC compared to untreated myelin mutants or Wt mice of the same age. However, this appears to be reduced as the disease progresses, since in the case of the 12-month-old Cx32def model animals fewer autophagically active SC profiles or hardly any differences between treated and untreated animals could be observed. The results thus suggest a possible active involvement of SC autophagy, particularly in the pathophysiology of the early phase of CMT1X disease and its influence by endoneural macrophages. This should primarily be considered in the development of therapeutic strategies for CMT1X, as an early reduction of pathophysiologically relevant endoneural macrophages could therefore also have a detrimental effect on myelin integrity.