Autosomal recessive spastic ataxia of Charlevoix-Saguenay (ARSACS) is a progressive neurodegenerative disorder that first presents in early childhood, with prominent symptoms of spasticity in limbs, gait ataxia, slower motor development, muscle wasting and slurred speech. The disease is due to mutations in the SACS gene, which codes for sacsin, a large multidomain protein found in neurons. Loss of sacsin function is associated with progressive loss of cerebellar Purkinje cells and hyperfused mitochondrial network, most likely due to loss of the mitochondrial fission efficiency. Most of sacsin is structurally and functionally uncharacterized. Sacsin is believed to play a role as a chaperone for promoting the folding of ataxia-related proteins. Bioinformatics analysis showed that sacsin contains an integral ubiquitin-like domain (UBL) domain, which was subsequently shown to weakly interact with the proteasomal subunit C-8 in the co-immunoprecipitation studies. The research work described in this thesis includes the incorporation of selenomethionine in the UBL sequence, crystallization of the selenomethionine-labeled UBL domain to produce well-diffracting crystals, and determination of the structure of the UBL domain by using the anomalous scattering signal from selenium. The UBL structure obtained is unusual as it is a swapped dimer formed by the exchange of the N-terminal portions of two molecules. The existence of dimer was confirmed in solution by PFG-NMR self-diffusion experiments. The hydrophobic patch that is usually responsible for interaction of the UBL domain with other proteins is occluded in the swapped dimer, which suggests that the sacsin UBL domain does not bind the proteasome as a dimer. / L'ataxie récessive spastique autosomale de Charlevoix-Saguenay (ARSACS) est une maladie neurodégénérative progressive dont les symptômes se présentent dès la petite enfance. Les symptômes les plus importants sont la spasticité dans les membres, l'ataxie, le développement plus lent des fonctions motrices, une atrophie musculaire et des troubles de l'élocution. La maladie est due à des mutations dans le gène SACS qui code pour la sacsine, une grande protéine multidomaine qui se trouve dans les neurones. La perte de fonction dans la sacsine est associée à la perte progressive des cellules de Purkinje du cervelet et à un réseau mitochondrial hyperfusionné, probablement due à une réduction de la fission mitochondriale. La structure et la fonction de la sacsine sont mal caractérisées. La sacsine est censée jouer un rôle de chaperon pour la promotion du repliement des protéines impliquées dans l'ataxie. Une analyse bioinformatique a montré que la sacsine contient un domaine homologue à l'ubiquitine (UBL). Des études de co-immunoprécipitation ont démontré que le domaine UBL interagirait avec la sous-unité du protéasome C-8. Le travail de recherche décrit dans cette thèse comprend l'incorporation de la sélénométhionine dans le domaine UBL, sa cristallisation et la détermination de sa structure à haute résolution par diffraction de rayons X et le signal de diffusion anomale du sélénium. La structure obtenue est inhabituelle et se présente comme un dimère formé par l'échange des parties N-terminales des deux molécules. L'existence du dimère a été confirmée en solution par des expériences d'auto-diffusion en RMN. Le site hydrophobique, qui est habituellement responsable de l'interaction des domaines UBL avec leurs ligands, est obstrué dans le dimère échangé ce qui suggère que le domaine UBL de la sacsine ne lie pas le protéasome sous forme de dimère.

It has long been known that silica is present in all vegetable and animal tissues. Most of it appears to be in a soluble form which is readily absorbed by the gut and excreted in the urine. A considerable fraction is also present in the skin, hair and other tissues. But the state of its occurrence is not known. The observation from spectroscopic analyses performed in our laboratory a few years ago, that silica is invariably present in the hard tissues and tends to be much higher in certain organs, prompted the present study, with a view to establishing whether there is a functional metabolism of silicon, or whether its presence is merely accidental. [...]

The hypothalamus is that part of the forebrain which forms the floor of the third ventricle in immediate topographical relation with the pituitary gland (1). The limiting boundary of the hypothalamus is ill-defined. It extends, without any sharp line of demarcation, into the parolfactory region of the telencephalon anteriorly and into the tegmental part of the mid-brain posteriorly. Laterally the hypothalamus is direct1y continuous with the subthalamus (1). [...]

Aminoglycosides are valuable broad-spectrum antibiotics effective in both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Antibiotic resistance has however been a scourge since the advent of modern antibiotics. One of the main mechanisms of resistance to aminoglycosides is antibiotic modification by the clinically widespread enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase (AAC(6')). Inhibiting resistance-causing enzymes is an important strategy among the multiple approaches to counter antibiotic resistance. The Auclair lab has previously developed a series of aminoglycoside-coenzyme A bisubstrates that was found to be potent inhibitors of AAC(6')-Ii, but lacked activity in cell-based assays. In order to combat aminoglycoside resistance, this thesis aims at developing a new class of AAC(6') inhibitors using fragment-based drug design with NMR-based assays for the initial screening. This approach has the advantage of potentially identifying new structural scaffolds that are fundamentally different from those that have been previously developed in the group. Following the introductory chapter 1, chapter 2 describes the NMR-based screening of a library of fragments against AAC(6')-Ii as well as the characterization of these hits in complex with the protein by NMR methods. Two hits with significant affinity for the enzyme were discovered, and their binding was further defined by HSQC methods. Chapter 3 describes the synthesis of derivatives of these initial hits, including hybrids, as well as the evaluation of their binding to AAC(6')-Ii using differential scanning fluorimetry and kinetic measurements. From the library of modified hits, only one was found to be an improvement over the initial hits. One of the hybrid molecules was found to have slightly improved affinity over the initial hits, but its activity was still too weak to be useful in further studies. / Les aminoglycosides sont une classe importante d'antibiotiques à large spectre, efficaces contre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives. La résistance des bactéries envers les antibiotiques demeure un problème depuis leur découverte. Un des mécanismes principaux de résistance aux aminoglycosides est leur modification par l'enzyme aminoglycoside N-6'-aminotransférase (AAC(6')). Inhiber la résistance antibiotique est une stratégie qui a fait ses preuves pour contrer ce problème. Le groupe Auclair a précédemment développé une série de bisubstrats aminoglycoside-coenzyme A qui sont de puissants inhibiteurs in vitro mais sont inefficaces dans des essais cellulaires. Pour combattre la résistance aux aminoglycosides, cette thèse vise le développement d'une nouvelle classe d'inhibiteurs d'AAC(6') en utilisant une approche par fragments avec des essais à base de RMN pour le criblage initial. Cette approche a l'avantage de potentiellement trouver de nouveaux patrons structurels, fondamentalement différents de ceux qui ont été précédemment découverts. Suivant l'introduction dans le chapitre 1. Le chapitre 2 décrit le criblage par RMN d'une librairie de composés avec l'enzyme AAC(6')-Ii. Les molécules actives ont ensuite été caractérisées en complexe avec la protéine par RMN dont la HSQC. Le chapitre 3 décrit la synthèse de composés modifiés basés sur les résultats du criblage initial aussi bien que la caractérisation de leur complexation avec l'enzyme par DSF et par mesures d'essais cinétiques. Seul un ligand a été trouvé un meilleur ligand que les ligands initiaux. Un des composés hybrides montrait une légère amélioration dans son affinité pour AAC(6')-Ii, mais son activité est trop faible pour que cet inhibiteur mérite de plus amples études.

Aminoglycosides are broad-spectrum antibiotics used in the treatment of serious infections. With the rapid emergence and spread of antibiotic resistance, their therapeutic use is becoming increasingly threatened. The most common mechanism of aminoglycoside resistance is the expression of aminoglycoside-modifying enzymes (AMEs). Aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii) is a chromosomally-encoded enzyme in Enterococcus faecium, which transfers an acetyl group from AcCoA to the 6'-NH2 of aminoglycosides. Many inhibitors of this enzyme have been reported by the Auclair group. Initially, bisubstrate inhibitors containing aminoglycoside and CoA moieties were generated, which were nanomolar inhibitors of AAC(6')-Ii, and served as useful structural and mechanistic probes. However, the presence of negatively charged phosphate groups precluded their membrane permeation and thus a second generation of truncated bisubstrate inhibitors was subsequently reported. It was demonstrated that the diphosphate group could effectively be mimicked by an acetoacetate moiety to afford a "lead" compound which was shown to be the first inhibitor active in cells, albeit at reduced activity over the bisubstrates. The work presented in this thesis encompasses a multi-faceted approach to targeting aminoglycoside resistance through 1) the inhibition of AAC(6')-Ii; and 2) the development of a novel class of antibacterial agents. A medicinal chemistry approach was used to improve the potency of the "lead" compound inhibitor through the insertion of alternative diphosphate mimics such as a squarate ester or an acetylsulfamate. As described in Chapter 2, we hoped this would improve upon the stability of the acetoacetate group, while maintaining key hydrogen-bonding interactions to the enzyme. The synthesis of these molecules however, proved more challenging than expected, and efforts were instead focused on the work described in subsequent chapters. In Chapter 3, a rigidification strategy was employed to improve the affinity of the lead molecule for AAC(6')-Ii by reducing the entropic cost of binding. Rigidified, triazole-containing derivatives were found to have a positive effect on the affinity of inhibitors for AAC(6')-Ii, and showed comparable in-cell activity to that of the lead. Next, Chapter 4 describes the use of a previously established prodrug strategy which capitalizes on the CoA biosynthetic pathway in order to extend aminoglycoside-pantetheine derivatives into potent bisubstrate inhibitors in cells. The effect of rigidification on the activity of the prodrugs was investigated. These compounds were not active in cells, which resulted from their poor in-cell extension. Finally, pantothenamide derivatives were synthesized and tested as reported in Chapter 5. Pantothenamides constitute a promising class of antibacterial agents, which has recently gained much attention. The molecules are extended by the CoA biosynthetic enzymes into inhibitors of downstream effector proteins. Chapter 5 reports the synthesis and biological activity of novel pantothenamides which were generated as part of a large-scale study. Although the molecules reported in this thesis were not the most active of the series, the results contribute to important SARs and provide a better understanding of the selectivity of PanK, the first, and rate-limiting step of CoA biosynthesis. Contributions and experimental methods comprise the final chapters of this thesis. / Les aminoglycosides sont des antibiotiques à large-spectre utilisés pour les infections sérieuses. Avec l'émergence et la propagation de la résistance antibiotique, leur usage thérapeutique devient de plus en plus précaire. Le mécanisme de résistance le plus commun est l'expression d'enzymes qui modifient les aminoglycosides (AME). Les AMEs fonctionalizent les aminoglycosides de façon régiosélective, ce qui réduit leur affinité pour le ribosome bactérien. Aminoglycoside 6'-N-acetyltransférase-Ii (AAC(6')-Ii), qui est encodé sur le chromosome d'Enterococcus faecium, transfert un groupement acétyl de AcCoA à l'amine 6' des aminoglycosides. Plusieurs inhibiteurs de cet enzyme ont été découverts par le groupe Auclair. Initialement, des inhibiteurs bisubstrats contenant une moitié aminoglycoside et une moitié CoA ont été générés, qui avaient une activité inhibitrice nanomolaire sur AAC(6')-Ii et on servis comme sondes structurelles et mécanistiques. Cependant la présence de charges négatives sur les groupements phosphates prévenaient leur activité dans des cellules vivantes. Une deuxième génération de bisubstrats tronqués ont ensuite été développés. Ces derniers ont démontré que le groupement diphosphate pouvait effectivement être imités par un groupement acétoacétyl. Une de ces molécules était le premier inhibiteur actif dans des cellules ("lead"), quoiqu'ayant une activité réduite comparé au bisubstrat original. Le travail présenté dans cette thèse englobe une approche multiforme visant à cibler la résistance aux aminoglycosides par l'inhibition d'AAC(6')-Ii et à contribuer au developpement d'une nouvelle classe d'agents antibactériens. Une approche de chimie médicinale a été utilisée pour améliorer la puissance de la molécule "lead" par l'insertion d'un ester de squarate ou d'une acétylsulfamate afin d'imiter le diphosphate. Tel que décrit dans le chapitre 2, cet approche visait à améliorer la stabilité du groupement acétoacétyl tout en conservant les intéractions clés de pont-hydrogène avec l'enzyme. La synthèse ayant posé un plus élevé qu'attendu, et nos efforts se sont rapidement concentrés sur les projets décrits dans les chapitres suivants. Tel que décrit dans le chapitre 3, une stratégie de rigidification a aussi été utilisée pour améliorer l'affinité et l'activité inhibitrice du composé d'intérêt pour AAC(6')-Ii en réduisant l'entropie de liaison. Les derivés rigidifiés ont amelioré l'affinité des inhibiteurs envers AAC(6')-Ii, et ont demontré une activité cellulaire similaire à celle du "lead." Le chapitre 4 décrit l'usage d'une approche précédemment utilisée et basée sur une pro-drogue qui exploite la voie de biosynthèse de CoA pour allonger les dérivés aminoglycoside-pantothéine en bisubstrats inhibiteurs dans les cellules. L'effet de la rigidification de ces molecules sur leur activité a été investiguées. Ces composés ce sont cependant montrés inactifs dans les cellules, probablement en raison d'un faible taux d'activation. Finalement, des dérivés pantothénamides ont été synthétisés et évalués comme décrit dans le chapitre 5. Les pantothénamides sont une nouvelle classe d'agents antibactériens qui a récemment jouit de beaucoup d'attention. Ces molécules sont transformées par les enzymes de biosynthèse de CoA pour ensuite affecter les enzymes qui utilizent CoA. Le chapitre 5 explore des nouvelles pantothénamides qui ont été générés dans le cadre d'une étude à large spectre. Quoique les molécules rapportées dans cette thèse ne soient pas les plus actifs, les resultats obtenuent contribuent à révéler d'importantes relations structures-activité et offrent de la séléctivité de PanK, l'enzyme limitante dans la biosynthèse de CoA. Les contributions et les méthodes expérimentales composent les deux dernier chapitres de cette thèse.

Death-associated protein 5 (DAP5/p97) is a homolog of the eukaryotic initiation factor 4G (eIF4G) that promotes the IRES-driven translation of multiple cellular mRNAs. Central to its function is the middle domain (MIF4G), which recruits the RNA helicase eIF4A. The middle domain of eIF4G consists of tandem HEAT repeats that coalesce to form a solenoid-type structure. Here, we report the crystal structure of the DAP5 MIF4G domain. Its overall fold is very similar to that of eIF4G, however, significant conformational variations impart distinct surface properties that could explain the observed differences in IRES binding between the two proteins. Interestingly, quantitative analysis of the DAP5-eIF4A interaction using isothermal titration calorimetry reveals a 10-fold lower affinity than with the eIF4G-eIF4A interaction that appears to affect their ability to stimulate eIF4A RNA unwinding activity in vitro. This difference in stability of the complex may have functional implications in selecting the mode of translation initiation. / Death-associated protein 5 (DAP5/p97) est une protéine homologue au facteur d'initiation eIF4G qui soutient la traduction d'ARN cellulaires contenant des éléments IRES chez les eukaryotes. Au centre de sa fonction est le domaine MIF4G, qui recrute l'ARN hélicase eIF4A. Ce domaine est constitué de motifs HEAT qui se répètent en tandem pour former une structure en forme de solénoïde. Nous rapportons ici la structure cristalline du domaine MIF4G de DAP5. Sa structure est très similaire à celle d'eIF4G. Toutefois, d'importantes variations de conformation lui confèrent des propriétés de surface distinctes qui pourraient expliquer les différences de liaison d'IRES observées entre les deux protéines. Notamment, l'analyse quantitative de l'interaction DAP5-eIF4A par calorimétrie de titration isotherme révèle une affinité 10 fois plus faible que l'interaction eIF4G-eIF4A, ce qui semble affecter la capacité de DAP5 à stimuler l'activité hélicasique d'eIF4A in vitro. Cette différence dans la stabilité du complexe pourrait être impliquée dans la sélection du mode d'initiation de la traduction.

The processes of learning and memory require accurate translational control of neuronal mRNAs. This control can be carried out through the regulation of the general translation machinery and upstream factors, as well as through the recognition and selective translation of specific mRNAs. In this work we explore two molecular mechanisms of translational control in neurons. First, we investigate the roles of RNA helicases eIF4A1 and DHX29 in controlling the translation of synaptically-localized mRNAs. We demonstrate the preferential translation of mRNAs with extensively structured 5'UTR, underlining the importance of this region in translational control. We also pinpoint the post-synaptic localization of DHX29 and propose a technique for monitoring the rate of 5'UTR-dependent translation in vivo with the use of a photoconvertible fluorescent reporter protein. Second, we study the role of cap-dependent translation in autism spectrum disorders (ASD) by examining translationally controlled mRNAs. We show that knockout of eIF4E binding protein 2 (4E-BP2, eIF4E repressor downstream of mTOR) or overexpression of eIF4E in mice lead to increased translation of neuroligin mRNAs, which can explain the autistic-like behaviours in these mice. Moreover, we design short hairpin RNAs packaged in lentiviral particles to modulate the expression of neuroligins in vivo. We use this technology to validate the mechanism of dysregulated neuroligin mRNA translation as the causal factor for the autism-like behaviour in the 4E-BP2 knockout mice. Finally, we propose a mechanism for the exaggerated translation of neuroligin mRNAs through their 5'UTRs. In conclusion, in this work we provide evidence that translational control of specific brain mRNAs is crucial for synaptic function and behaviour. / Les processus d'apprentissage et de mémoire requièrent un contrôle précis de la traduction des ARNm présents dans les neurones. Ce contrôle peut être exercé au niveau de la machinerie traductionnelle et des facteurs en amont de celle-ci, mais aussi au niveau des ARNm, en reconnaissant et en traduisant les molécules messagères de façon sélective. Dans cet ouvrage nous étudions deux mécanismes de régulation traductionnelle dans les cellules nerveuses. En premier lieu, nous explorons les rôles des hélicases eIF4A1 et DHX29 dans la régulation de la traduction des ARNm localisés aux synapses. Nous confirmons que la traduction des ARNm contenant une région 5' non traduite (5'UTR) complexe est favorisée, soulignant de ce fait l'importance de cette région dans la régulation traductionnelle. Nous démontrons que DHX29 se trouve surtout dans l'élément postsynaptique et proposons une méthode de surveillance du taux de traduction in vivo selon la complexité de la 5'UTR à l'aide d'un gène rapporteur codant une protéine fluorescente photoconvertible. En second lieu, nous étudions le rôle de traduction dans le cas des troubles du spectre autistique (TSA) en examinant la régulation traductionnelle de certains ARNm. Nous démontrons que l'invalidation (knock-out) de 4E-BP2 (eIF4E-binding protein 2) ou la surexpression de eIF4E dans des souris mène à la traduction accrue des ARNm des neuroligines, ce qui pourrait expliquer le comportement autistique de ces souris. De plus, nous concevons des lentivirus remplis de petits ARN en épingle à cheveux (shRNA) destinés à moduler l'expression des neuroligines in vivo. Nous utilisons cette technologie afin de prouver que la dysrégulation de la traduction des ARNm des neuroligines est une cause majeure du comportement autistique parmi les souris knock-out pour 4E-BP2. Enfin, nous proposons une explication de la traduction exagérée des ARNm des neuroligines en examinant leur 5'UTR. Pour conclure, dans cet ouvrage nous fournissons la preuve de l'importance de la régulation traductionnelle des ARNm pour le propre fonctionnement du système nerveux.

Protein disulfide isomerases (PDIs) constitute a family of thiol oxidoreductases that catalyze oxidation, reduction, and isomerization of disulfide bonds in the endoplasmic reticulum (ER). Human P5 (PDIA6) is a PDI family member that affects the prognosis of diseases such as glioblastoma multiforme and hepatocellular carcinoma (HCC). P5 is a protein which contains three domains, catalytically active domains 1 and 2 joined by a flexible linker and a non thiol-reactive domain 3. Here, we determined high-resolution crystal structures of all three P5 domains. The domains all possess a thioredoxin-like structural fold, and the active site of both catalytic domains contains a CGHC motif. The structure of the non-catalytic domain shows a large hydrophobic pocket that could serve as a potential substrate-binding site, similar to PDIA1. Interestingly, this site is blocked by a C-terminal tail that wraps around the non-catalytic domain. This may provide a mechanism of auto-regulation of P5 activity. While its precise function is still unknown, P5 has been shown to interact with BiP, an Hsp70 homolog found in the ER. BiP chaperone prevents protein aggregation and functions in ER quality control. We used pull-down assays, NMR and X-ray crystallography in order to characterize the interaction between P5 and BiP. Pull-downs showed that full-length P5 binds specifically to the nucleotide-binding domain (NBD) of BiP. The affinity is decreased in the presence of ATP, while the binding is not affected by addition of reducing agent. We obtained the crystal structure of the nucleotide-binding domain of BiP in complex with ADP that reveals a conformational switch not observed in previous structures. This switch could mimic structural changes that occur when NBD associates with partner proteins. Interestingly, this region is adjacent to R197, a residue critical for binding to DNAj-type proteins. NMR titrations suggest that P5 and DNAj-type proteins do not compete with each other for BiP binding, but could potentially form a ternary complex. Another less-studied PDI, protein disulfide isomerase-related (PDIR) protein (PDIA5), is a specialized member that participates in the folding of α1-antitrypsin and N-linked glycoproteins. In this thesis, the crystal structure of the non-catalytic domain of PDIR was determined to 1.5 Å resolution. The structure adopts a thioredoxin-like fold stabilized by a structural disulfide bridge with a positively charged binding surface for interactions with the ER chaperones, calreticulin and ERp72. Crystal contacts between molecules potentially mimic the interactions of PDIR with misfolded substrate proteins. The results suggest that the non-catalytic domain of PDIR plays a key role in the recognition of protein partners and substrates. Understanding the molecular mechanisms of folding will facilitate the development of therapeutic strategies because aberrant protein folding has a role in a variety of diseases. Further characterization of P5 and PDIR will provide a greater understanding of the BiP and calnexin/calreticulin folding pathways that are responsible for maintaining ER integrity. / Les protéines disulfure isomérases (PDI) constituent une famille de thio-oxydoréductases qui catalysent l'oxydation, la réduction et l'isomérisation des ponts disulfures dans le réticulum endoplasmique (RE). La protéine P5 humaine (PDIA6) est un membre de la famille des PDI qui affecte le pronostic de maladies telles que le glioblastome multiforme et le carcinome hépatocellulaire (CHC). P5 est une protéine qui contient trois domaines fonctionnels. Les domaines catalytiques 1 et 2 qui sont thio-actifs et reliés par une région flexible sont suivis par un troisième domaine non-réactif. Dans ce travail, nous avons déterminé les structures cristallines à haute résolution des trois domaines de la protéine P5. Ils possèdent tous une structure semblable à celle de la thiorédoxine et le site actif de chacun des deux domaines catalytiques contient un motif CGHC. La structure du domaine non catalytique montre une grande poche hydrophobe qui pourrait potentiellement servir de site de liaison pour le substrat, comme dans le cas de PDIA1. Il est intéressant de noter que ce site est bloqué par l'extrémité C-terminale qui s'enroule autour du domaine non-catalytique. Cela pourrait constituer un mécanisme d'auto-régulation de l'activité P5. Alors que sa fonction précise est encore inconnue, il a été montré que P5 pouvait interagir avec BiP, un homologue de la protéine Hsp70 du réticulum endoplasmique (RE). La chaperonne BiP empêche l'agrégation des protéines et a un rôle de contrôle de la qualité dans le RE. Nous avons utilisé des assais d'immunoprécipitation, de resonnance magnétique nucléaire (RMN) et de cristallographie aux rayons X pour caractériser l'interaction entre les protéines P5 et BiP. Les essais d'immunoprécipitation ont montré que la protéine P5 se liait spécifiquement au domaine de de liaison nucléotidique (NBD) de BiP. L'affinité diminue en présence d'ATP alors que la liaison n'est pas affectée par l'addition d'un agent réducteur. Nous avons déterminé la structure cristalline du domaine de liaison nucléotidique de BiP en complexe avec l'ADP qui révèle un changement de conformation qui n'avait pas été observé dans les structures antérieures. Ce changement de conformation pourrait imiter les changements structurels qui se produisent lorsque le NBD s'associe avec d'autres protéines. Il est intéressant de noter que cette région est adjacente au R197, un acide aminé critique pour la liaison aux protéines qui contiennent un domaine DNAj. Les expériences de titrage RMN suggèrent que la protéine P5 et ainsi que celles qui contiennent un domaine DNAj n'entrent pas en concurrence les uns avec les autres pour BiP, mais qu'elles pourraient former un complexe ternaire. Une autre protéine moins étudiée de la famille des PDI, PDIR (PDIA5), est un membre spécialisé qui participe au repliement des protéines α1-antitrypsine et des glycoprotéines N-linked. Durant cette thèse, la structure cristalline du domaine non catalytique de PDIR a été déterminée à une résolution de 1,5 Å. Sa structure adopte un repliement semblable à celui de la thiorédoxine stabilisé par un pont disulfure structurel et une surface de liaison chargée positivement pour les interactions avec les chaperones de l'ER calréticuline et ERp72. Les contacts entre les molécules au sein du cristal imitent potentiellement les interactions de la protéine PDIR avec un substrat mal replié. Les résultats suggèrent que le domaine non catalytique du PDIR joue un rôle clé dans la reconnaissance des protéines partenaires et des substrats.Comme le repliement anormal des protéines est impliqué dans une variété de maladies, la compréhension des mécanismes moléculaires de leur repliement facilitera le développement de stratégies thérapeutiques. Une caractérisation plus poussée de P5 et de PDIR permettra de mieux comprendre les voies de repliement dans lesquelles sont impliquées les protéines BiP et calnexine/calréticuline qui sont responsables du maintien de l'intégrité du réticulum endoplasmique.

The structure and molecular forms of human placental type V collagen preparations containing (alpha)1(V), (alpha)2(V) and (alpha)3(V) chains were investigated. Crude human placental preparations containing native (alpha)1(V), (alpha)2(V) and (alpha)3(V) chains were resolved into two fractions by three independent nondenaturing methods (phosphocellulose chromatography, high performance ion exchange chromatography and ammonium sulphate fractionation). One fraction contained (alpha)1(V) and (alpha)2(V) chains in a 2:1 ratio and the other contained (alpha)1(V), (alpha)2(V) and (alpha)3(V) chains in a 1:1:1 ratio. The collagen in each fraction behaved as one homogeneous, native and distinct entity as determined by CD spectroscopy, resistance to trypsin/chymotrypsin digestion and electrophoresis under nondenaturing conditions. Trypsin cleaved collagens in both fractions at temperature near melting producing completely different fragmentation patterns, indicating that (alpha)1(V) and (alpha)2(V) chains in the two fractions were assembled in two different molecular forms. The collagens in the two fractions were also shown to differ in antigenic determinants in their native assemblies. (alpha)1(V) chains isolated from the two fractions were shown to differ in at least one antigenic determinant. / These data clearly demonstrate the existence of two distinct molecular forms of (alpha)1(V) (,2) (alpha)2(V) and (alpha)1(V) (alpha)2(V) (alpha)3(V) in human placenta.

The core of this research project revolves around the development of knowledge and expertise in the field of sequence homology identification techniques, as applied towards the discovery of Bcl2 family members. The use of such methods resulted in the uncovering of a Bcl2 Homology 3 (BH3) domain in a ubiquitin ligase enzyme known as upstream regulatory binding protein 1 (UreB1). A complete biochemical analysis unequivocally demonstrated binding of the UreB1 BH3 domain to MCL-1, an antiapoptotic member of the Bcl2 protein family. Furthermore, the discovery of a BH3 domain in UreB1 may provide a link in the established involvement of the ubiquitin pathway in the degradation of Mcl1 following certain apoptotic stimuli. In addition, using an independent domain modelling strategy, we describe the development of BISA, a web-accessible software package for sequence homology detection.