Orientadores: Eduardo Galembeck, Carmen Verissima Ferreira Halder / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:42:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Milani_Renato_D.pdf: 7268876 bytes, checksum: dfdb9d30aafa024539f758590409a4ca (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A leucemia mieloide crônica, caracterizada principalmente pelo gene de fusão BCR-ABL, ainda necessita de novos tratamentos aos pacientes, como ocorre com outros tipos de câncer. A resistência a quimioterápicos é um dos principais obstáculos a serem superados para o sucesso em seu tratamento. Assim, a identificação dos mecanismos moleculares que promovem e mantêm o fenótipo resistente a múltiplas drogas (MDR) é de extrema importância para a evolução dos protocolos terapêuticos. Contudo, ainda pouco se sabe sobre as vias de sinalização envolvidas nestes eventos. O mapeamento das vias de sinalização nas células resistentes pode gerar informações para o entendimento da resistência, bem como apontar alvos para a intervenção farmacológica. Neste trabalho, apresentamos uma análise comparativa do proteoma e fosfoproteoma das células K562 (célula leucêmica não resistente) e Lucena-1 (célula leucêmica resistente a múltiplas drogas). Diversas ferramentas biocomputacionais foram criadas para auxiliar na análise dos dados, com destaque para uma ferramenta, batizada de PhosphoActivity, capaz de enriquecer conjuntos de dados obtidos a partir de fosfoproteomas com os sítios responsáveis pela ativação e pela inibição das proteínas associadas a cada fragmento fosforilado. Estas ferramentas foram empregadas para reduzir o conjunto de 2209 proteínas e 4257 peptídios fosforilados correspondentes a 2053 fosfoproteínas identificadas por espectrometria de massas. Através da combinação de dados experimentais com predições baseadas em aprendizado de máquina, foram selecionadas 145 proteínas e fosfoproteínas para validação. A seleção inclui fatores de transcrição e proteínas estruturais, como ?-catenina, HDAC6 e o filamento intermediário vimentina. As proteínas e fosfoproteínas identificadas e validadas através de métodos computacionais e experimentais apontaram o envolvimento de vias como a reorganização do citoesqueleto, a proliferação celular e o metabolismo de carboidratos na quimiorresistência de Lucena-1. Além disso, a identificação da proteína tirosina fosfatase LMW-PTP como tendo um papel central na resistência em Lucena-1 aponta a natureza complexa e multifatorial deste processo / Abstract: Chronic myeloid leukemia, characterized by the BCR-ABL fusion gene, still poses challenges to patient treatment. One of them is chemoresistance, a major barrier for successful therapy approaches. Still, the molecular mechanisms responsible for promoting and keeping the multiple drug resistance (MDR) phenotype are largely unknown. The mapping of phosphorylation events in resistant cells may improve disease understanding at the cellular level and suggest new targets for pharmacological intervention. Here we present a comparative analysis of the proteome and phosphoproteome in K562, a chronic myeloid leukemia cell line, and Lucena-1, a K562-derived chemoresistant line. We developed several bioinformatics tools to help analyze the data, such as a phosphoproteomics dataset enrichment tool, titled PhosphoActivity, that is able to retrieve documented sites responsible for the activation or inhibition of the proteins related to each phosphorylated fragment. These tools were employed to sift through 2290 proteins and 4257 phosphorylated peptides corresponding to 2053 phosphoproteins previously identified by mass spectrometry. Combining experimental data with support vector machine-based predictions, we selected 145 proteins and phosphoproteins for validation. The selection includes transcription regulators and structural proteins, such as ?-catenin, HDAC6 and the intermediary filament vimentin. Proteins and phosphoproteins identified and validated through computational and epxerimental methods suggest the involvement of pathways such as cytoskeleton rearrangement, cell lproliferation and carbohydrate metabolism in the chemoresistance of Lucena-1. Furthermore, the identification of LMW-PTP, a protein tyrosine phosphatase, as having a pivotal role in the resistance process in Lucena-1, suggests it as a complex and multifactorial process / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: José Andrés Yunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:04:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Laranjeira_AngeloBrunelliAlbertoni_D.pdf: 13248620 bytes, checksum: 729ec8e23331934ddd1e5803361b6fe6 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Leucemia Linfóide Aguda (LLA) é o tipo de câncer mais comum que acomete crianças. Sabe-se que a interação do tumor com o contexto celular do hospedeiro (microambiente tumoral) é recíproca, ou seja, na medida em que o tumor estimula o seu microambiente, este potencializa a sobrevivência, proliferação e invasividade tumoral. A interação da LLA com as células estromais da medula óssea tem um impacto positivo na resistência das células leucêmicas à quimioterapia. No presente estudo foi investigado a modulação de uma série genes de sensibilidade e resistência à asparaginase em células de LLA-B precursoras após co-cultura com as células estromais. Mostramos o aumento da expressão e secreção da IGFBP7 pelas células leucêmicas após co-cultivo com células do estroma da medula óssea. Em ensaios com o silenciamento do IGFBP7 em células leucêmicas e células estromais, mostramos que a IGFBP7 atua regulando positivamente o crescimento celular e aumenta a resistência a asparaginase. A IGFBP7 'leucêmica' junto com IGF/insulina atua sobre as células estromais, induzindo nestas células o aumento da produção de asparagina, e diminuindo a ação da asparaginase. Além deste mecanismo de resistência dependente das células estromais, mostramos que a IGFBP7 em conjunto com IGF/insulina promove a resistência das células leucêmicas à ação de outros compostos quimioterápicos (dexametasona e metotrexato) de forma independente da interação leucemia-estroma. Ainda pode ser observado que o plasma de crianças com LLA ao diagnóstico, apresenta maiores níveis de IGFBP7 do que em amostras controles. É importante ressaltar que níveis mais altos de mRNA IGFBP7 foram associados com menor sobrevida livre de leucemia (Modelo de regressão de Cox, P = 0,003), em células de LLAB Ph(-) presursoras / Abstract: Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is the most common type of cancer that affects children. It is known that the interaction between tumor and the cellular context of the host (tumor microenvironment) is reciprocal, ie, to the extent that the tumor stimulates their microenvironment, this enhances the survival, proliferation and tumor invasiveness. The interaction of ALL with bone marrow stromal cells has a positive impact on leukemia resistance to chemotherapy. In the present study, we investigated the modulation of a series of putative asparaginase-resistance/sensitivity genes in B-precursor ALL upon co-culture with stromal cells. We showed an increase expression and secretion of IGFBP7 in leukemic cells after co-culture with BMSCs. Assays with IGFBP7 knockdown in leukemic cells and stromal cells, showed that IGFBP7 acts as a positive regulator of cell growth and increases resistance to asparaginase. 'Leukemic' IGFBP7 together with IGF/insulin acts on stromal cells, increasing asparagine production, thus reducing the asparaginase effect. Besides this mechanism of resistance dependent of stromal cells, we showed that IGFBP7 in conjunction with IGF/insulin promotes the resistance of leukemia cells to the action of other chemotherapeutic compounds (dexamethasone and methotrexate) independently of the interaction leukemia-stroma. We still observed that diagnostic BM plasma from children with ALL at diagnosis, have higher levels of IGFBP7 than control samples. Importantly, higher levels of IGFBP7 mRNA were associated with lower leukemia-free survival (Cox regression model, P = 0.003) in precursor B-ALL Ph (-) patients / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular