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A endometriose é uma doença ginecológica benigna que se associa a um desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigénio e as defesas antioxidantes. Foi descrita, ainda, uma correlação entre a endometriose e a incidência de eventos cardiovasculares. Assim, o presente estudo tem por objetivo analisar a via metabólica AMPK/SIRT1/PGC-1α/SIRT3 na resposta ao stress oxidativo no coração de um modelo de murganho com endometriose. Foi também estudado o efeito da metformina, um fármaco capaz de potenciar a ação da insulina e exercer efeito antioxidante previamente demonstrado no tecido endometriótico. Trinta e seis fêmeas de ratinho B6CBA/F1 foram dividias em 4 grupos (Controlo-C, Indução cirúrgica de Endometriose e Metformina-EM (administrada oralmente durante 3 meses em dose de 50mg/Kg/dia), Endometriose-E e Metformina-M). Foi efetuada deteção de SIRT1 e SIRT3 em tecido cardíaco por imunofluorescência. Foi avaliada a expressão de AMPKα, SIRT1, PGC-1α, SIRT3, SOD2, e GPX1 por Western Blot. A quantificação dos microRNA envolvidos na regulação da expressão de SIRT1 e SIRT3, miR-34a, miR-195, miR-217, miR-155 e miR-421 foi efetuada por Real-Time PCR. A análise dos dados revelou um aumento significativo da fosfo-AMPK e da expressão de GPX1 no grupo EM quando comparado com o grupo controlo. Não se observaram diferenças na expressão de AMPK total, SIRT1, PGC-1α, SIRT3 e SOD2, sugerindo um aumento da expressão de GPX1 de forma independente da via AMPK/SIRT1/PGC-1α/SIRT3. Os microRNA revelaram uma tendência constante de aumento no grupo M relativamente aos outros grupos, à exceção do miR-217. Em suma, este estudo mostrou que a endometriose tem um impacto reduzido na expressão dos constituintes da via AMPK/SIRT1/PGC-1α/SIRT3 no coração, evidenciando simultaneamente um efeito benéfico da metformina em indivíduos com endometriose através do aumento da expressão da enzima antioxidante GPX1. / Endometriosis is a gynecological disease associated with an imbalance between oxidative species production and anti-oxidative defenses. In women, a correlation has been reported between endometriosis and incidence of cardiovascular events. As such, this study aimed to analyze the oxidation-responsive AMPK/SIRT1/PGC-1α/SIRT3 pathway in the heart of a mouse model of endometriosis. The effect of metformin, an insulin-sensitizing and anti-oxidative drug with already shown positive results in endometriotic tissue was also studied. Thirty-six female B6CBA/F1 mice were divided into 4 groups (Control-C, Surgery-induced Endometriosis and Metformin-EM (50 mg/Kg/day orally administrated for 3 months), Endometriosis-E and Metformin-M). Immunofluorescent labelling of SIRT1 and SIRT3 was performed in heart tissue. Assessment of expression of AMPKα, SIRT1, PGC-1α, SIRT3, SOD2, and GPx1 was carried out by Western Blotting. The quantification of microRNA(miR)-34a, miR-195, miR-217, miR-155 and miR-421, involved in the regulation of expression of SIRT1 and SIRT3, was performed by Real-Time PCR. Data showed an increase in phospho-AMPKα and in GPx1 expression in the EM group when compared to the C group, but not in the total AMPK, SIRT1, PGC-1α, SIRT3 and SOD2, suggesting a GPx1 expression increase independently of the AMPK/SIRT1/PGC-1α/SIRT3 pathway. MicroRNAs, excepting miR-217, showed a consistent trend of increase in the M group. Collectively, our study showed that endometriosis does not significantly affect the expression of the components of the AMPK/SIRT1/PGC-1α/SIRT3 pathway in the heart. However, it indicates that an oxidative condition underlying endometriosis is required for metformin to evidence a beneficial antioxidant effect by increasing the expression of the anti-oxidative enzyme GPx1.

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Os fatores de risco cardiovasculares (FRCVs), especialmente a diabetes mellitus (DM), interferem com a resposta ao stress oxidativo. Este mecanismo está associado à disfunção endotelial, manifestada precocemente nos homens como disfunção erétil. O presente estudo tem como objetivo elucidar o impacto dos FRCVs na via AMPK / SIRT1-PGC-1α-SIRT3 e miRNAs relacionados na resposta oxidativa no corpo cavernoso humano. Fragmentos de tecido peniano humano de indivíduos submetidos à cirurgias urológicas programadas (n = 27), com idades entre 43 e 63 anos, foram agrupados segundo a presença de FRCVs; o grupo controle incluiu amostras de pacientes sem FRCVs, os grupos A e B incluíram amostras de pacientes com DM e FRCVs adicionais, totalizando ≤2 FRCVs (grupo A) e ≥3 FRCVs (grupo B). Foi realizada imunomarcação dupla de SIRT3, SOD2 ou GPX1 com α-actina nos cortes de tecido. A obtenção dos níveis de expressão de NOX1, fosfo-AMPKα, AMPKα total, SIRT1, PGC-1α, SIRT3, SOD2 e GPX1 foi realizada por Western blotting, e a expressão de miR-200a, miR-34a, miR-421 e miR-206 por real-time PCR. A expressão de fosfo-AMPKα e SIRT3 estava significativamente aumentada no grupo B em relação aos outros grupos, sugerindo uma influência acentuada dos FRCVs, adicionais à DM, na regulação dessas enzimas. A NOX1 também observou-se aumentada no grupo B em relação aos controles. Apenas uma tendência crescente foi observada na relação fosfo-AMPKα / AMPKα total e na expressão de SIRT1 e PGC-1α nos grupos A e B quando comparados aos controles. Em relação às enzimas antioxidantes, a expressão de GPX1 estava aumentada no grupo A, mas a expressão de SOD2 estava reduzida nos grupos A e B, comparativamente aos controles. O grupo B apresentou níveis significativamente reduzidos de miR-421 e miR-200a, mas apenas uma tendência decrescente na expressão de miR-34 e miR-206 foi observada. Em resumo, nossos achados demonstraram que, além da DM, FRCVs adicionais apresentam um efeito acumulativo na resposta celular ao desequilíbrio oxidativo, contribuindo para a ativação da via AMPK / SIRT1-PGC-1α-SIRT3. O SOD2, a principal defesa antioxidante mitocondrial, não apresentou a mesma variação. / Cardiovascular disease risk factors (CVDRF), especially diabetes mellitus (DM), disrupts oxidative stress response. This condition underlies endothelial dysfunction, early manifested in men as erectile dysfunction. Current study aims to elucidate the impact of CVDRF in the oxidation responsive AMPK/SIRT1-PGC-1α-SIRT3 pathway and related miRNAs in human corpus cavernosum. Human penile tissue fragments from individuals submitted to programmed urological surgeries (n=27), aged 43-63 years, were clustered depending on the presence of CVDRF; control group included samples from patients without CVDRF, groups A and B included samples from patients with DM and additional CVDRF, totalizing ≤2 CVDRF (group A) and ≥3 CVDRF (group B). Dual immunolabelling of SIRT3, SOD2 or GPX1 with α-actin in tissue sections was carried out. The assessment of expression levels of NOX1, phospho-AMPKα, total AMPKα, SIRT1, PGC-1α, SIRT3, SOD2 and GPX1 was performed by Western blotting and of miR-200a, miR-34a, miR-421 and miR-206 by real-time PCR. Phospho-AMPKα and SIRT3 expression was found significantly increased in group B relatively to other groups, suggesting a marked influence of CVDRF, additional to DM, in the regulation of these enzymes. NOX1 was also increased in group B relatively to controls. Only an increasing tendency was observed in phospho-AMPKα/total AMPKα ratio, SIRT1 and PGC-1α expression in groups A and B when compared with controls. Concerning anti-oxidant enzymes, GPX1 expression was found incremented in group A but, SOD2 expression was decreased in groups A and B, comparatively with controls. Group B presented significantly diminished levels of miR-421 and miR-200a, but only a decreasing trend on miR-34 and miR-206 expression was observed. Taken together, our findings demonstrated that besides DM, additional CVDRF presented a cumulative effect in the cellular response to oxidative unbalance, contributing to AMPK/SIRT1-PGC-1α-SIRT3 pathway activation. SOD2, a major mitochondrial anti-oxidant defence, didn´t follow the same variation.

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