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Etude fonctionnelle de la protéine associée aux microtubules XMAP215/ch-TOGPaez, Claudia 29 April 2011 (has links) (PDF)
Résumé Les protéines XMAP215/ch-TOG appartiennent à une famille de protéines associées aux microtubules (MAPs), bien conservée tout au long de l'évolution, la famille XMAP215/Dis1. Cette famille joue un rôle dans la régulation du cytosquelette des microtubules (MT), en particulier pendant la division cellulaire. Chez l'humain, ch-TOG est la protéine surexprimée dans les tumeurs du colon et du foie, une protéine qui provient de cellules blastiques et de plusieurs formes de cancer. Certaines protéines XMAP215/ch-TOG ont été retrouvées dans différentes localisations cellulaires, toujours reliées aux MTs, donnant origine à une activité spécifique. Cependant, la localisation exacte de XMAP215/ch-TOG ainsi que son activité restait à être déterminées. Dans ce contexte scientifique, nous avons développé une série d'anticorps monoclonaux (mcAB) qui nous ont permis d'identifier deux populations différentes de la famille des protéines XMAP215/Dis1. Les images de microscopie confocale des cellules fixées ont montré une première localisation, la colocalisation bien connue XMAP215-microtubulaire (MT-XMAP215) qui s'observe pendant l'interphase et pendant la mitose (fuseau mitotique). Une deuxième localisation a été identifiée sur le bout plus des MTs, donnant XMAP215/ch-TOG comme faisant parti de la famille des protéines de bout plus (+TIPs). Cette deuxième colocalisation a été identifiée comme +TIP XMAP215/ch-TOG. La +TIP XMAP215 est la protéine la plus distale du bout des MTs. La hiérarchie a été établie en faisant la comparaison de la localisation de XMAP215/ch-TOG avec les protéines les plus connues du bout plus, telles qu'EB1, CLIP170 et p150Glued. Dans l'extrait mitotique de Xenopus laevis, les images obtenues in vivo par la microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF) ont permis d'identifier une +TIP XMAP215 présente au bout des MTs qui polymérisent et dépolymérisent. Les images de microscopie cryo-électronique (Cryo-EM) ont montré une activité spécifique de la population +TIP XMAP215. Dans les solutions de tubuline pure, XMAP215 induit la formation de structures au bout des MTs, cette activité est compatible avec les mécanismes de croissance des MTs. Sur la base de nos résultats, nous proposons un modèle où XMAP215 se charge des dimères de tubuline en devenant une structure de type protofilament. Cette structure se lie au bout du MT en utilisant son domaine C-terminal, en rajoutant les dimères de tubuline et aussi certainement en participant à la fermeture de la structure microtubulaire même. La protéine interviendrait donc dans la dépolymérisation et aurait un rôle dans le mécanisme de dépolymérisation contrôlée. Une fois que l'addition de tubuline a eu lieu, la +TIP XMAP215 pourrait évoluer en MT-XMAP215, la forme la plus connue de la protéine qui a été associée au trafic des granules d'ARN. Mots cles : XMAP215, ch-TOG, microtubules, anticorps monoclonaux.
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Etude fonctionnelle de la protéine associée aux microtubules XMAP215/ch-TOG / Fonctional study of microtubule associated protein XMAP215/ch-TOGPaez, Claudia 29 April 2011 (has links)
Résumé Les protéines XMAP215/ch-TOG appartiennent à une famille de protéines associées aux microtubules (MAPs), bien conservée tout au long de l'évolution, la famille XMAP215/Dis1. Cette famille joue un rôle dans la régulation du cytosquelette des microtubules (MT), en particulier pendant la division cellulaire. Chez l'humain, ch-TOG est la protéine surexprimée dans les tumeurs du colon et du foie, une protéine qui provient de cellules blastiques et de plusieurs formes de cancer. Certaines protéines XMAP215/ch-TOG ont été retrouvées dans différentes localisations cellulaires, toujours reliées aux MTs, donnant origine à une activité spécifique. Cependant, la localisation exacte de XMAP215/ch-TOG ainsi que son activité restait à être déterminées. Dans ce contexte scientifique, nous avons développé une série d'anticorps monoclonaux (mcAB) qui nous ont permis d'identifier deux populations différentes de la famille des protéines XMAP215/Dis1. Les images de microscopie confocale des cellules fixées ont montré une première localisation, la colocalisation bien connue XMAP215-microtubulaire (MT-XMAP215) qui s'observe pendant l'interphase et pendant la mitose (fuseau mitotique). Une deuxième localisation a été identifiée sur le bout plus des MTs, donnant XMAP215/ch-TOG comme faisant parti de la famille des protéines de bout plus (+TIPs). Cette deuxième colocalisation a été identifiée comme +TIP XMAP215/ch-TOG. La +TIP XMAP215 est la protéine la plus distale du bout des MTs. La hiérarchie a été établie en faisant la comparaison de la localisation de XMAP215/ch-TOG avec les protéines les plus connues du bout plus, telles qu'EB1, CLIP170 et p150Glued. Dans l'extrait mitotique de Xenopus laevis, les images obtenues in vivo par la microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF) ont permis d'identifier une +TIP XMAP215 présente au bout des MTs qui polymérisent et dépolymérisent. Les images de microscopie cryo-électronique (Cryo-EM) ont montré une activité spécifique de la population +TIP XMAP215. Dans les solutions de tubuline pure, XMAP215 induit la formation de structures au bout des MTs, cette activité est compatible avec les mécanismes de croissance des MTs. Sur la base de nos résultats, nous proposons un modèle où XMAP215 se charge des dimères de tubuline en devenant une structure de type protofilament. Cette structure se lie au bout du MT en utilisant son domaine C-terminal, en rajoutant les dimères de tubuline et aussi certainement en participant à la fermeture de la structure microtubulaire même. La protéine interviendrait donc dans la dépolymérisation et aurait un rôle dans le mécanisme de dépolymérisation contrôlée. Une fois que l'addition de tubuline a eu lieu, la +TIP XMAP215 pourrait évoluer en MT-XMAP215, la forme la plus connue de la protéine qui a été associée au trafic des granules d'ARN. Mots cles : XMAP215, ch-TOG, microtubules, anticorps monoclonaux. / Summary XMAP215/ch-TOG are members of an evolutionary conserved family of microtubule-associated proteins (MAPs), the XMAP215/Dis1 family. This family of proteins plays a key role in the regulation of the microtubule (MT) cytoskeleton, particularly during the cell division. In humans, ch-TOG is the colon-hepatic tumor overexpresed gene, a protein whose sequence was originally reported from blastic cells and from several forms of cancer. A few members of the XMAP215/ch-TOG family have been found to be present in different cell localizations, always MT-related, perhaps providing in this way a selected activity. However, the XMAP215/ch-TOG exact localization and activity has remained as a theory to be probed. In this scientifical context, we developed a series of monoclonal antibodies (mcABs) that allow us to identify two different populations of the XMAP215/ Dis1 family of proteins. Confocal images of fixed cells revealed a first and well known XMAP215/ch-TOG population, a microtubular-XMAP215 (MT-XMAP215), co-localizing with microtubules (MTs) in interphase and mitotic spindle. A second localization was identified at the tips of growing MTs, placing XMAP215/ch-TOG as one more member of the known microtubule plus end tracking proteins (+TIPs). This second population was identified as the +TIP XMAP215/ch-TOG. The + TIP XMAP215 is the most distal +TIP protein at the tip of MTs. The + TIPs hierarchy was established comparing the XMAP215/ch-TOG localization with other well known + TIPs proteins such as EB1, CLIP170 and p150Glued. In the Xenopus laevis mitotic egg extract, the Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) In vivo images, identified a +TIP XMAP215 that is present at the tip of polymerizing and depolymerising MTs. Cryo-electron microscopy (Cryo-EM) images probed a selective activity for the +TIP XMAP215 population. In pure tubulin solutions XMAP215 shown to promote the formation of outwardly sheet structures at the tip of MTs, compatible with growing mechanisms in MTs. Based in our results we propose a model where free XMAP215 is previously loaded with tubulin dimers to become a protofilament-like structure. This structure joins the MT tip using its C-terminal domain, not only adding the tubulin dimmers but also perhaps participating in the MT sheet closure. The possibility that the protein participates in the MT depolymerization could be associated to a “controlled” depolymerization mechanism. Once the tubulin addition has taken place, the +TIP XMAP215 protein could evolve to a MT-XMAP215, the well know form of the protein that has been related to the RNA granules traffic. Key words: XMAP215, ch-TOG, microtubules, monoclonal antibodies.
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Role of Tem1 phosphorylation in the control of mitotic exit and spindle positioning / Rôle de la phosphorylation de Tem1 dans le contrôle de la sortie de mitose et du positionnement du fuseau mitotiquePietruszka, Patrycja 27 November 2013 (has links)
Dans la levure S. cerevisiae, la mitose nécessite le positionnement du fuseau mitotique le long de l’axe cellule mère-bourgeon (future cellule fille) afin d‘assurer une bonne ségrégation des chromosomes. Ce phénomène requiert le fonctionnement de deux mécanismes impliquant les protéines Kar9 et Dyn1. Durant la métaphase, Kar9 se positionne de manière asymétrique le long du fuseau mitotique, avec une accumulation notable sur les microtubules qui émanent de l’ancien « spindle pole body » (SPB; l’équivalent du centrosome dans les vertébrés), qui est normalement dirigé vers le bourgeon. Dans le cas d’un défaut d’alignement du fuseau mitotique, un mécanisme appelé « Spindle Position Checkpoint » (SPOC) inhibe la sortie de mitose et la cytokinèse, afin de permettre un réalignement correct du fuseau mitotique. La principale cible de ce checkpoint est une GTPase Tem1. Dans le cas d’alignement correct du fuseau mitotique, Tem1 active une voie de signalisation appelée le « Mitotic Exit Network » (MEN) qui permet de mener à la sortie de mitose et à la cytokinèse. Lors de la transition métaphase/anaphase Tem1 se positionne asymétriquement sur les SPBs jusqu’à se concentrer majoritairement sur l’ancien SPB. Des données récentes ont montré que des composants du MEN, Tem1 inclus, sont également impliqués dans la régulation de la localisation de la protéine Kar9 à l’SPB, et dans l’établissement d’une polarité correcte des SPBs durant la métaphase. En effet, Kar9 se positionne plus symétriquement dans le cas des mutants du MEN que dans le type sauvage, ce qui engendre des problèmes d’orientation du fuseau et de ségrégation des SPBs. Nous cherchons à élucider comment l’activité du MEN régule la localisation de Kar9 et l’orientation du fuseau mitotique en métaphase alors que les fonctions du MEN liées à la sortie de mitose restent bloquées jusqu’à la télophase. Nous avons émis l’hypothèse que les modifications post-traductionnelles de Tem1 pourraient jouer un rôle dans la régulation du MEN. Il a été montré que les résidus Y40 et Y45 sont phosphoryles in vivo. Afin de disséquer le rôle de ces résidus nous les avons mutés en phénylalanines. Ces mutations peuvent complémenter la létalité induite par la délétion de TEM1, suggérant que ce mutant conserve les fonctions essentielles de Tem1. Par ailleurs, la cinétique de progression du cycle cellulaire du mutant est la même que celle du type sauvage, signifiant que la perte de phosphorylation sur Tem1 ne semble pas agir sur la sortie de mitose. De plus, l’allèle mutant n’affecte pas la localisation aux SPBs de Tem1 ni celle de sa « GTPase-activating protein » Bub2/Bfa1 durant le cycle cellulaire. Bien que l’activité GTPasique de la protéine Tem1-Y40F,Y45F soit réduite in vitro, les mutations ne causent pas des défauts de SPOC in vivo et le mutant répond efficacement au mauvais alignement de fuseau mitotique en s’arrêtant en anaphase. Tous ces résultats nous suggèrent que la perte de phosphorylation de Tem1 n’affecte pas les fonctions de fin de mitose de cette GTPase. Par contre, nous avons découvert que la phosphorylation de Tem1 est requise pour la localisation asymétrique de Kar9 sur les SPBs, ainsi que pour l’alignement correct du fuseau mitotique durant la métaphase (la distribution de Kar9 est plus symétrique dans les cellules TEM1-Y40F,Y45F et que le fuseau mitotique n’est pas aligné correctement). Nous cherchons alors à trouver quelle kinase phosphoryle Tem1 et régule son activité. Les kinases potentielles sont la protéine Swe1 (la seule vraie kinase phosphorylant les tyrosines dans la levure) ainsi que la kinase Mps1 (kinase qui contrôle la duplication des SPBs). Nous développons actuellement des outils nous permettant de vérifier l’implication de ces deux candidats. Mots clés : Tem1, Kar9, cycle cellulaire, Mitotic Exit Network (MEN), Spindle Position Checkpoint (SPOC), phosphorylation on tyrosines. / In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae a faithful mitosis requires positioning of the mitotic spindle along the mother-bud axis to ensure proper chromosome segregation. This is achieved by two distinct but functionally redundant mechanisms that require the APC (adenomatous polyposis coli)-like protein Kar9 and dynein (Dyn1), respectively. During metaphase, Kar9 localizes asymmetrically on the mitotic spindle, with a prominent accumulation on astral microtubules emanating from the old spindle pole body (SPB – i.e. the yeast equivalent of the centrosome) that is normally directed towards the bud. In case of spindle misalignment, a surveillance mechanism called Spindle Position Checkpoint (SPOC) inhibits mitotic exit and cytokinesis, thereby providing the time necessary to correct spindle alignment. The main target of the SPOC is the small GTPase Tem1, which activates a signal transduction cascade called Mitotic Exit Network (MEN) that drives cells out of mitosis and triggers cytokinesis. Tem1 is localized at SPBs, with an increasingly asymmetric pattern during the progression from metaphase to anaphase, when Tem1 is concentrated on bud-directed old SPB. Recent data have implicated MEN components also in the regulation of Kar9 localization at SPBs and in setting the right polarity of SPBs inheritance during metaphase. In particular, Kar9 localizes more symmetrically in MEN mutants than in wild type cells and this leads to spindle orientation and SPB inheritance defects (i.e. with the new SPB being oriented towards the bud). A key question emerging from these data is how MEN activity is regulated to promote proper Kar9 localization and spindle positioning in metaphase, while being restrained until telophase for what concerns its mitotic exit and cytokinetic functions. We hypothesised that Tem1 post-translational modifications might be relevant for this control and for this reason we have been focusing on the role of Tem1 phosphorylation. Tem1 was found in a wide phosphoproteomic study to be phosphorylated on two tyrosines (Y40 and Y45) located at its N-terminus. We constructed a non-phosphorylatable mutant, TEM1-Y40F,Y45F, where the two phosphorylated tyrosines were mutated to phenylalanine. This mutant allele was able to rescue the lethality caused by TEM1 deletion, suggesting that it retains all its the essential functions. The kinetics of cell cycle progression of TEM1-Y40F,Y45F cells was similar to that of wild type cells, suggesting that lack of Tem1 phosphorylation is unlikely to affect mitotic exit. In addition, the TEM1-Y40F,Y45F allele did not affect the SPB localization of Tem1 and its regulatory GTPase-activating protein Bub2/Bfa1 during the cell cycle. Moreover, although the Tem1-Y40F,Y45F mutant protein showed reduced GTPase activity in vitro, it did not cause SPOC defects in vivo and could efficiently respond to spindle mispositioning. Altogether, these results suggest that lack of Tem1 phosphorylation does not affect the late mitotic functions of the GTPase. In contrast, we found that Tem1 phosphorylation is required for Kar9 asymmetry at SPBs and proper spindle positioning during metaphase. Indeed, TEM1-Y40F,Y45F cells display a more symmetric pattern of Kar9 distribution at SPBs in this cell cycle stage, as well as spindle position and orientation defects. We are currently investigating if Tem1 phosphorylation also regulates the pattern of SPB inheritance. Finally, an important question that we are trying to answer is “what is the kinase that phosphorylates Tem1?” The best candidates are the wee1-like kinase Swe1, which is the only true tyrosine kinase of budding yeast, and Mps1, a dual-specificity protein kinase controlling SPB duplication. While we are developing specific tools to study Tem1 phosphorylation and ultimately identify its promoting kinase, we gained preliminary data suggesting that both kinases might be involved in spindle positioning.
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