A ciclosporina (CsA) é um agente imunossupressor freqüentemente utilizado na clínica para a prevenção da rejeição ao transplante e no tratamento de doenças auto-imunes. Apesar da ação no sistema imune, o tratamento com CsA apresenta efeitos adversos graves. Múltiplos fatores de confusão na prática clínica, incluindo fatores de risco prévios, diferenças genéticas e de resposta imune dos receptores do órgão dificultam a determinação dos efeitos adversos especificamente relacionados ao tratamento com CsA. A busca por protocolos de imunossupressão eficazes, que não afetem a qualidade de vida dos pacientes conduz a investigação do envolvimento da CsA em doenças vasculares. A doença vascular é uma das principais causas de morbidade e mortalidade entre pacientes transplantados e o tratamento com CsA parece estar envolvido neste evento. O objetivo desta tese foi investigar parâmetros bioquímicos sistêmicos envolvidos em distúrbios vasculares induzidos pelo tratamento crônico com CsA em ratos não-transplantados. Primeiramente, demonstramos que o nosso protocolo de administração de CsA foi capaz de induzir imunossupressão, com diminuição dos níveis séricos de citocinas que medeiam a resposta imunológica (IL-1α, IL-1β e IL-2), sem causar nefro e hepatotoxicidade. Além disso, verificamos um perfil bioquímico coerente com intolerância à glicose, incluindo a diminuição dos níveis séricos de insulina em jejum e alteração do teste de tolerância à glicose, sugerindo o desenvolvimento de um perfil de diabetes em ratos tratados com CsA 15 mg/kg. O tratamento com CsA também aumentou os níveis de homocisteína total (tHcy), um fator de risco para doenças cardiovasculares. Os níveis de fibrinogênio no plasma, o número de plaquetas, os níveis séricos de triglicérides, colesterol e VLDL também aumentaram com o tratamento de CsA 15 mg/kg. Além disso, demonstramos que a atividade ecto-nucleotidásica sobre nucleotídeos de adenina em soro foi inibida pelo tratamento com CsA. Ratos tratados com CsA apresentaram uma diminuição na hidrólise de ATP, ADP e AMP em soro, além de aumento dos níveis plasmáticos de ADP e redução dos níveis de adenosina (ADO). Enquanto os níveis de tHcy correlacionaram-se negativamente com a inibição da hidrólise de nucleotídeos e os níveis plasmáticos de ADO, esta correlação foi positiva para os níveis plasmáticos de ADP. Isto sugere que a inibição da atividade ectonucleotidásica pode estar relacionada ao aumento dos níveis séricos de tHcy. Além disso, a análise morfológica de ratos tratados com CsA 15 mg/kg apresentou lesão celular e resposta inflamatória envolvendo o endotélio e a camada íntima da artéria aorta. Em conclusão, as evidências obtidas nesta tese podem ser relevantes para futuros estudos que visam investigar os mecanismos de ação da CsA sobre os distúrbios vasculares que acompanham seu uso. Além disso, contribuímos para a elucidação de um método de quantificação das purinas derivadas da adenina e guanina em plasma e líquor por HPLC. Esta metodologia tem sido amplamente utilizada em amostras de humanos, ratos e camundongos, contribuindo para o esclarecimento dos mecanismos de ação das purinas. / Cyclosporine (CsA) is an immunosuppressive agent frequently used in the clinic for prevention of allograft rejection and for the treatment of autoimmune diseases. Despite its desired action on the immune system, CsA treatment may present serious adverse effects. It is difficult to distinguish, in the clinical setting, a direct effect of CsA treatment from other confounding variables, such as allograft rejection and effects due to other drug therapies. The search for effective immunosuppression protocols which does not affect the quality of life of patients is driving research to investigate the CsA involvement in vascular diseases. Vascular disease is a major cause of morbidity and mortality among transplanted recipients and CsA treatment has been consistently implicated in this event. Here, we investigate systemic biochemical parameters involved in vascular disturbances induced by chronic CsA treatment in non-transplanted rats. Firstly, we demonstrate that our CsA immunosuppressive protocol was able to induce immunosuppression by decreasing the serum levels of cytokines that mediate immunological responses (IL-1α, IL-1β and IL-2) without causing nephro and hepatotoxicity. Moreover, we demonstrate biochemical profile coherent with glucose intolerance, including decreased fasting serum insulin levels and altered glucose tolerance test, suggesting the development of a framework straight to diabetes on CsA 15 mg/kg treated group. CsA treatment also increased serum total homocysteine (tHcy) concentration, an important and independent risk factor for cardiovascular diseases. Plasma fibrinogen levels, platelet number, serum triglycerides, cholesterol and VLDL were also increased by CsA 15 mg/kg treatment. Also, we showed that ectonucleotidase activities on adenine nucleotides in serum were inhibited by CsA treatment. CsA treated rats showed a decrease in serum ATP, ADP and AMP hydrolyzes, and increased ADP and decreased ADO plasma levels. THcy levels correlated negatively with the inhibition of nucleotides hydrolyzes and ADO plasma levels, and positively with ADP plasma levels. These correlations suggest that the inhibition of serum ecto-nucleotidase activities could be related to the increase of serum tHcy levels. In addition, morphological evaluation of CsA 15 mg/kg treated rats exhibited cell injury and inflammatory response involving the endothelium and the intimal layer of aorta artery. In conclusion, the evidences obtained in this thesis may be relevant for future studies that aim to investigate the mechanisms of action of CsA on vascular disturbances that accompany patients under immunosuppressive therapy with CsA. In addition, we contribute to the elucidation of a method for quantification of adenine- and guanine-based purines in plasma and cerebrospinal fluid by HLPC. This methodology has been widely used in human, mice and rats samples, contributing to the elucidation of the mechanisms of action of purines.

A ciclosporina (CsA) é um agente imunossupressor freqüentemente utilizado na clínica para a prevenção da rejeição ao transplante e no tratamento de doenças auto-imunes. Apesar da ação no sistema imune, o tratamento com CsA apresenta efeitos adversos graves. Múltiplos fatores de confusão na prática clínica, incluindo fatores de risco prévios, diferenças genéticas e de resposta imune dos receptores do órgão dificultam a determinação dos efeitos adversos especificamente relacionados ao tratamento com CsA. A busca por protocolos de imunossupressão eficazes, que não afetem a qualidade de vida dos pacientes conduz a investigação do envolvimento da CsA em doenças vasculares. A doença vascular é uma das principais causas de morbidade e mortalidade entre pacientes transplantados e o tratamento com CsA parece estar envolvido neste evento. O objetivo desta tese foi investigar parâmetros bioquímicos sistêmicos envolvidos em distúrbios vasculares induzidos pelo tratamento crônico com CsA em ratos não-transplantados. Primeiramente, demonstramos que o nosso protocolo de administração de CsA foi capaz de induzir imunossupressão, com diminuição dos níveis séricos de citocinas que medeiam a resposta imunológica (IL-1α, IL-1β e IL-2), sem causar nefro e hepatotoxicidade. Além disso, verificamos um perfil bioquímico coerente com intolerância à glicose, incluindo a diminuição dos níveis séricos de insulina em jejum e alteração do teste de tolerância à glicose, sugerindo o desenvolvimento de um perfil de diabetes em ratos tratados com CsA 15 mg/kg. O tratamento com CsA também aumentou os níveis de homocisteína total (tHcy), um fator de risco para doenças cardiovasculares. Os níveis de fibrinogênio no plasma, o número de plaquetas, os níveis séricos de triglicérides, colesterol e VLDL também aumentaram com o tratamento de CsA 15 mg/kg. Além disso, demonstramos que a atividade ecto-nucleotidásica sobre nucleotídeos de adenina em soro foi inibida pelo tratamento com CsA. Ratos tratados com CsA apresentaram uma diminuição na hidrólise de ATP, ADP e AMP em soro, além de aumento dos níveis plasmáticos de ADP e redução dos níveis de adenosina (ADO). Enquanto os níveis de tHcy correlacionaram-se negativamente com a inibição da hidrólise de nucleotídeos e os níveis plasmáticos de ADO, esta correlação foi positiva para os níveis plasmáticos de ADP. Isto sugere que a inibição da atividade ectonucleotidásica pode estar relacionada ao aumento dos níveis séricos de tHcy. Além disso, a análise morfológica de ratos tratados com CsA 15 mg/kg apresentou lesão celular e resposta inflamatória envolvendo o endotélio e a camada íntima da artéria aorta. Em conclusão, as evidências obtidas nesta tese podem ser relevantes para futuros estudos que visam investigar os mecanismos de ação da CsA sobre os distúrbios vasculares que acompanham seu uso. Além disso, contribuímos para a elucidação de um método de quantificação das purinas derivadas da adenina e guanina em plasma e líquor por HPLC. Esta metodologia tem sido amplamente utilizada em amostras de humanos, ratos e camundongos, contribuindo para o esclarecimento dos mecanismos de ação das purinas. / Cyclosporine (CsA) is an immunosuppressive agent frequently used in the clinic for prevention of allograft rejection and for the treatment of autoimmune diseases. Despite its desired action on the immune system, CsA treatment may present serious adverse effects. It is difficult to distinguish, in the clinical setting, a direct effect of CsA treatment from other confounding variables, such as allograft rejection and effects due to other drug therapies. The search for effective immunosuppression protocols which does not affect the quality of life of patients is driving research to investigate the CsA involvement in vascular diseases. Vascular disease is a major cause of morbidity and mortality among transplanted recipients and CsA treatment has been consistently implicated in this event. Here, we investigate systemic biochemical parameters involved in vascular disturbances induced by chronic CsA treatment in non-transplanted rats. Firstly, we demonstrate that our CsA immunosuppressive protocol was able to induce immunosuppression by decreasing the serum levels of cytokines that mediate immunological responses (IL-1α, IL-1β and IL-2) without causing nephro and hepatotoxicity. Moreover, we demonstrate biochemical profile coherent with glucose intolerance, including decreased fasting serum insulin levels and altered glucose tolerance test, suggesting the development of a framework straight to diabetes on CsA 15 mg/kg treated group. CsA treatment also increased serum total homocysteine (tHcy) concentration, an important and independent risk factor for cardiovascular diseases. Plasma fibrinogen levels, platelet number, serum triglycerides, cholesterol and VLDL were also increased by CsA 15 mg/kg treatment. Also, we showed that ectonucleotidase activities on adenine nucleotides in serum were inhibited by CsA treatment. CsA treated rats showed a decrease in serum ATP, ADP and AMP hydrolyzes, and increased ADP and decreased ADO plasma levels. THcy levels correlated negatively with the inhibition of nucleotides hydrolyzes and ADO plasma levels, and positively with ADP plasma levels. These correlations suggest that the inhibition of serum ecto-nucleotidase activities could be related to the increase of serum tHcy levels. In addition, morphological evaluation of CsA 15 mg/kg treated rats exhibited cell injury and inflammatory response involving the endothelium and the intimal layer of aorta artery. In conclusion, the evidences obtained in this thesis may be relevant for future studies that aim to investigate the mechanisms of action of CsA on vascular disturbances that accompany patients under immunosuppressive therapy with CsA. In addition, we contribute to the elucidation of a method for quantification of adenine- and guanine-based purines in plasma and cerebrospinal fluid by HLPC. This methodology has been widely used in human, mice and rats samples, contributing to the elucidation of the mechanisms of action of purines.

A ciclosporina (CsA) é um agente imunossupressor freqüentemente utilizado na clínica para a prevenção da rejeição ao transplante e no tratamento de doenças auto-imunes. Apesar da ação no sistema imune, o tratamento com CsA apresenta efeitos adversos graves. Múltiplos fatores de confusão na prática clínica, incluindo fatores de risco prévios, diferenças genéticas e de resposta imune dos receptores do órgão dificultam a determinação dos efeitos adversos especificamente relacionados ao tratamento com CsA. A busca por protocolos de imunossupressão eficazes, que não afetem a qualidade de vida dos pacientes conduz a investigação do envolvimento da CsA em doenças vasculares. A doença vascular é uma das principais causas de morbidade e mortalidade entre pacientes transplantados e o tratamento com CsA parece estar envolvido neste evento. O objetivo desta tese foi investigar parâmetros bioquímicos sistêmicos envolvidos em distúrbios vasculares induzidos pelo tratamento crônico com CsA em ratos não-transplantados. Primeiramente, demonstramos que o nosso protocolo de administração de CsA foi capaz de induzir imunossupressão, com diminuição dos níveis séricos de citocinas que medeiam a resposta imunológica (IL-1α, IL-1β e IL-2), sem causar nefro e hepatotoxicidade. Além disso, verificamos um perfil bioquímico coerente com intolerância à glicose, incluindo a diminuição dos níveis séricos de insulina em jejum e alteração do teste de tolerância à glicose, sugerindo o desenvolvimento de um perfil de diabetes em ratos tratados com CsA 15 mg/kg. O tratamento com CsA também aumentou os níveis de homocisteína total (tHcy), um fator de risco para doenças cardiovasculares. Os níveis de fibrinogênio no plasma, o número de plaquetas, os níveis séricos de triglicérides, colesterol e VLDL também aumentaram com o tratamento de CsA 15 mg/kg. Além disso, demonstramos que a atividade ecto-nucleotidásica sobre nucleotídeos de adenina em soro foi inibida pelo tratamento com CsA. Ratos tratados com CsA apresentaram uma diminuição na hidrólise de ATP, ADP e AMP em soro, além de aumento dos níveis plasmáticos de ADP e redução dos níveis de adenosina (ADO). Enquanto os níveis de tHcy correlacionaram-se negativamente com a inibição da hidrólise de nucleotídeos e os níveis plasmáticos de ADO, esta correlação foi positiva para os níveis plasmáticos de ADP. Isto sugere que a inibição da atividade ectonucleotidásica pode estar relacionada ao aumento dos níveis séricos de tHcy. Além disso, a análise morfológica de ratos tratados com CsA 15 mg/kg apresentou lesão celular e resposta inflamatória envolvendo o endotélio e a camada íntima da artéria aorta. Em conclusão, as evidências obtidas nesta tese podem ser relevantes para futuros estudos que visam investigar os mecanismos de ação da CsA sobre os distúrbios vasculares que acompanham seu uso. Além disso, contribuímos para a elucidação de um método de quantificação das purinas derivadas da adenina e guanina em plasma e líquor por HPLC. Esta metodologia tem sido amplamente utilizada em amostras de humanos, ratos e camundongos, contribuindo para o esclarecimento dos mecanismos de ação das purinas. / Cyclosporine (CsA) is an immunosuppressive agent frequently used in the clinic for prevention of allograft rejection and for the treatment of autoimmune diseases. Despite its desired action on the immune system, CsA treatment may present serious adverse effects. It is difficult to distinguish, in the clinical setting, a direct effect of CsA treatment from other confounding variables, such as allograft rejection and effects due to other drug therapies. The search for effective immunosuppression protocols which does not affect the quality of life of patients is driving research to investigate the CsA involvement in vascular diseases. Vascular disease is a major cause of morbidity and mortality among transplanted recipients and CsA treatment has been consistently implicated in this event. Here, we investigate systemic biochemical parameters involved in vascular disturbances induced by chronic CsA treatment in non-transplanted rats. Firstly, we demonstrate that our CsA immunosuppressive protocol was able to induce immunosuppression by decreasing the serum levels of cytokines that mediate immunological responses (IL-1α, IL-1β and IL-2) without causing nephro and hepatotoxicity. Moreover, we demonstrate biochemical profile coherent with glucose intolerance, including decreased fasting serum insulin levels and altered glucose tolerance test, suggesting the development of a framework straight to diabetes on CsA 15 mg/kg treated group. CsA treatment also increased serum total homocysteine (tHcy) concentration, an important and independent risk factor for cardiovascular diseases. Plasma fibrinogen levels, platelet number, serum triglycerides, cholesterol and VLDL were also increased by CsA 15 mg/kg treatment. Also, we showed that ectonucleotidase activities on adenine nucleotides in serum were inhibited by CsA treatment. CsA treated rats showed a decrease in serum ATP, ADP and AMP hydrolyzes, and increased ADP and decreased ADO plasma levels. THcy levels correlated negatively with the inhibition of nucleotides hydrolyzes and ADO plasma levels, and positively with ADP plasma levels. These correlations suggest that the inhibition of serum ecto-nucleotidase activities could be related to the increase of serum tHcy levels. In addition, morphological evaluation of CsA 15 mg/kg treated rats exhibited cell injury and inflammatory response involving the endothelium and the intimal layer of aorta artery. In conclusion, the evidences obtained in this thesis may be relevant for future studies that aim to investigate the mechanisms of action of CsA on vascular disturbances that accompany patients under immunosuppressive therapy with CsA. In addition, we contribute to the elucidation of a method for quantification of adenine- and guanine-based purines in plasma and cerebrospinal fluid by HLPC. This methodology has been widely used in human, mice and rats samples, contributing to the elucidation of the mechanisms of action of purines.

As infecções são a causa mais freqüente de morbidade e mortalidade observadas tanto aguda como tardiamente nos pacientes receptores de transplante pulmonar, o que pode estar diretamente relacionado a uma deficiência no transporte mucociliar do sistema respiratório. Nosso objetivo foi avaliar a influência de dois fatores envolvidos com o transplante pulmonar sobre o transporte mucociliar de ratos: a secção e anastomose brônquica e a imunossupressão pela ciclosporina A. Setenta e dois ratos foram distribuídos aleatoriamente em cinco grupos de acordo com: i) procedimento operatório e ii) terapia a que seriam submetidos. Os resultados mostram que houve uma diminuição significativa da Freqüência de Batimento Ciliar in situ, da Transportabilidade do Muco in vitro e da Velocidade de Transporte Mucociliar in situ medidos a partir do brônquio principal esquerdo dos ratos tratados com ciclosporina A (p<0,001). A Freqüência de Batimento Ciliar in situ dos brônquios operados mostrou-se diminuída também no grupo tratado com solução salina e sacrificado no 30º dia após a operação (p=0,001). Já a Velocidade de Transporte Mucociliar in situ mostrou uma diminuição significativa em todos os grupos submetidos à secção brônquica (p<0,001). Houve um efeito sinérgico entre a terapia com ciclosporina A e a secção brônquica, causando um prejuízo ao transporte mucociliar ainda maior do que quando analisados isoladamente. Concluímos que a Velocidade de Transporte Mucociliar in situ foi agudamente prejudicada após a secção brônquica e terapia imunossupressora pela ciclosporina A, havendo diminuição da freqüência de batimento dos cílios e alteração das propriedades viscoelásticas do muco respiratório. / Infections are the most common cause of early and late morbidity and mortality in lung transplant recipient, and can be directly related to impaired mucociliary transport. Our aim was to assess the influence of bronchial section and imunossupression on mucociliary transport in rats. Seventy two rats were randomly distributed in five groups according to i) surgical procedure and ii) drug therapy. There was a significant impairment on Ciliary Beating Frequency in situ, Mucus Transportability Rate in vitro and Mucociliary Transport Speed in situ from operated bronchus of cyclosporine A-treated rats (p<0.001). Ciliary Beating Frequency from operated bronchus was also impaired in saline-treated rats that were killed on 30th postoperative day (p=0.001). Mucociliary Transport Speed was impaired in all bronchi underwent to section (p<0.001). We conclude that bronchial section and cyclosporine therapy impaired all factors analyzed. Also there was a synergic effect between cyclosporine therapy and bronchial section on ciliary beating frequency.

As infecções são a causa mais freqüente de morbidade e mortalidade observadas tanto aguda como tardiamente nos pacientes receptores de transplante pulmonar, o que pode estar diretamente relacionado a uma deficiência no transporte mucociliar do sistema respiratório. Nosso objetivo foi avaliar a influência de dois fatores envolvidos com o transplante pulmonar sobre o transporte mucociliar de ratos: a secção e anastomose brônquica e a imunossupressão pela ciclosporina A. Setenta e dois ratos foram distribuídos aleatoriamente em cinco grupos de acordo com: i) procedimento operatório e ii) terapia a que seriam submetidos. Os resultados mostram que houve uma diminuição significativa da Freqüência de Batimento Ciliar in situ, da Transportabilidade do Muco in vitro e da Velocidade de Transporte Mucociliar in situ medidos a partir do brônquio principal esquerdo dos ratos tratados com ciclosporina A (p<0,001). A Freqüência de Batimento Ciliar in situ dos brônquios operados mostrou-se diminuída também no grupo tratado com solução salina e sacrificado no 30º dia após a operação (p=0,001). Já a Velocidade de Transporte Mucociliar in situ mostrou uma diminuição significativa em todos os grupos submetidos à secção brônquica (p<0,001). Houve um efeito sinérgico entre a terapia com ciclosporina A e a secção brônquica, causando um prejuízo ao transporte mucociliar ainda maior do que quando analisados isoladamente. Concluímos que a Velocidade de Transporte Mucociliar in situ foi agudamente prejudicada após a secção brônquica e terapia imunossupressora pela ciclosporina A, havendo diminuição da freqüência de batimento dos cílios e alteração das propriedades viscoelásticas do muco respiratório. / Infections are the most common cause of early and late morbidity and mortality in lung transplant recipient, and can be directly related to impaired mucociliary transport. Our aim was to assess the influence of bronchial section and imunossupression on mucociliary transport in rats. Seventy two rats were randomly distributed in five groups according to i) surgical procedure and ii) drug therapy. There was a significant impairment on Ciliary Beating Frequency in situ, Mucus Transportability Rate in vitro and Mucociliary Transport Speed in situ from operated bronchus of cyclosporine A-treated rats (p<0.001). Ciliary Beating Frequency from operated bronchus was also impaired in saline-treated rats that were killed on 30th postoperative day (p=0.001). Mucociliary Transport Speed was impaired in all bronchi underwent to section (p<0.001). We conclude that bronchial section and cyclosporine therapy impaired all factors analyzed. Also there was a synergic effect between cyclosporine therapy and bronchial section on ciliary beating frequency.