CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A cistite hemorrÃgica (CH) à um fenÃmeno inflamatÃrio frequentemente associado à quimioterapia com oxazafosforinas. Trata-se de uma resposta inflamatÃria inata à aÃÃo da AcroleÃna (ACR), metabÃlito hepÃtico comum à Ifosfamida (IFO) e à ciclofosfamida (CTX). O papel da resposta ao recrutamento de receptores toll-like (TLR) e do estÃmulo por TNF-α e IL-1β com envolvimentto de iNOS e COX-2 tem sido demonstrado neste fenÃmeno. Estudos recentes demonstram que a Pentraxina 3 (PTX3) assume papel de mediador inflamatÃrio em modelos de resposta inflamatÃria inata in vivo, sobretudo relacionada ao recrutamento de TLR. Desta forma, o presente estudo pretende investigar o possÃvel envolvimento de PTX3 na patogÃnese da CH induzida por ifosfamida em camundongos. Para isso, foi realizada quantificaÃÃo de RNAm por RT-PCR para PTX3 e IL-1β em camundongos C57/ BL6 tratados com ifosfamida e salina. Em seguida, o modelo experimental da CH induzida por ifosfamida foi reproduzido em grupos de camundongos com hiperexpressÃo e nocauteados para PTX3 em comparaÃÃo com os respectivos controles do tipo selvagem e com grupos controle tratados com salina para posterior obtenÃÃo dos pesos vesicais Ãmidos (PVU), realizaÃÃo de anÃlise histomorfomÃtrica, imunohistoquÃmica e quantificaÃÃo de RNAm por RT-PCR para PTX3, IL-1β, TNF-α e iNOS. Os animais transgÃnicos e seus controles foram sacrificados com tempos de 3h e 12h apÃs o tratamento, enquanto os nocauteados e seus controles foram sacrificados com 12 horas do tratamento. Finalmente, a CH em animais C57/ BL6 foi modulada com o prÃ-tratamento com Talidomida, Pentoxifilina, MESNA, Amifostina e Aminoguanidina para a posterior marcaÃÃo imunohistoquÃmica com PTX3, IL-1β, TNF-α e iNOS. Observou-se que o RNAm de PTX3 està cerca de 70 vezes mais expresso em animais com CH, contra uma razÃo de expressÃo de 10 para IL-1β. Animais trangÃnicos para PTX3 tÃm reduÃÃo inicial da resposta inflamatÃria com expressÃo inferior de PTX3 e TNF-α e expressÃo aumentada de iNOS e intensificaÃÃo da inflamaÃÃo ao tempo de 12 horas, com expressÃo superior dos mediadores. NÃo houve diferenÃas significativas de intensidade da CH em animais KO em relaÃÃo aos controles. A modulaÃÃo da CH por talidomida e MESNA produziu reduÃÃo importante sobre a expressÃo de PTX3, enquanto a inibiÃÃo da CH por amifostina nÃo teve reduÃÃo expressiva da pentraxina. Em conjunto, estes dados apontam para um envolvimento inequÃvoco de PTX3 na fisiopatologia da inflamaÃÃo inata em modelo de CH murino com Ãntima relaÃÃo coma expressÃo de TNF-α / The Hemorrhagic Cystitis (HC) is an inflammatory reaction usually associated with Cancer Chemotherapy with Oxazaphosphorines. It is an innate inflammatory response to vesical irritation by Acrolein, an hepatic metabolite of the treatment with Iphosphamide and Cyclophosphamide. The role of toll-like receptor (TLR) engagement and TNF-α and IL-1β expression and the involvement of iNOS and COX-2 in the pathogenesis has been well demonstrated in a murine model of HC. Recent data configure pentraxin 3 (PTX3) as an inflammatory mediator in several experimental models of innate immune response in vivo, with a straight relation with TLR engagement. Because of that, this study looks at the involvement of PTX3 in the pathogenesis of iphosphamideâinduced HC in mice. For this purpose, the mRNA to PTX3 and IL-1β t was quantified by RT-PCR in groups of C57BL6 mice treated with Iphosphamide or Saline. After that, groups of transgenic and Knock-Out mice to PTX3 and its respectives wild-type controls were treated with Iphosphamide or saline with intention to measure the Bladder Wet Weight (BWW), histomorphometric scores and Immunohistochemistry and RT-PCR to PTX3, IL-1β, TNF-α e iNOS analysis. The transgenic mice and its controls were killed in 3h and 12h after the treatment, while the PTX3 KO and its controls were killed after 12 hours. Finally, the experimental HC was modulated by pretreatment with Talidomide, Pentoxiphiline, MESNA, Amifostine and Aminoguanidine and the bladders submitted to immunohistochemistry assay (PTX3, TNF-α, IL-1β and iNOS). By RT-PCR quantification, mRNA for PTX3 was expressed 70 times more in mice treated with iphosphamide than in controls, while IL-1β RNAm had an expression rate of 10 times. PTX3 transgenic mice had initial reduction of the inflammatory response with less expression of PTX3 and TNF-α and greater expression of iNOS. In the other hand, after 12 hours, the PTX3 transgenic mice had more inflammatory signs with superior expression of all the mediators. There was no difference between the PTX3 KO mice and its controls in the HC intensity although differences between groups were seen in cytokines expression. Talidomide and MESNA produced substantial reduction on the PTX3 expression, the same was seen to TNF-α, while the amifostine marked inhibition of HC had low effect on PTX3 expression. These data as a whole, point to an unequivocal involvement of PTX3 in the pathogenesis of innate inflammatory response of HC in mice with close relation with TNF-α engagement

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A cistite hemorrÃgica (CH) à um efeito indesejado limitante do uso clÃnico dos agentes quimioterÃpicos do grupo das oxazafosforinas, principalmente ciclofosfamida (CFS) e ifosfamida (IFS). Isto se deve à formaÃÃo de acroleÃna como subproduto do metabolismo dessas drogas. A partir de prÃvios trabalhos conduzidos no LaboratÃrio de Farmacologia da InflamaÃÃo e do CÃncer da Universidade Federal do CearÃ, sabe-se que o Ãxido nÃtrico (NO) atravÃs da ativaÃÃo de iNOS, o fator de ativaÃÃo plaquetÃria, citocinas, como o TNF-α e IL-1β, e prostaglandinas, pela ativaÃÃo da enzima ciclooxigenase-2 (COX-2), sÃo mediadores chave envolvidos nos eventos inflamatÃrios da CH, evidenciados pelo dano urotelial, edema e hemorragia. Sabendo-se que interleucina- 4 (IL- 4) à uma citocina antiinflamatÃria capaz de prevenir a produÃÃo de TNF-α, IL-1β e de atenuar a expressÃo de enzimas inflamatÃrias como iNOS e COX-2, foi investigado se IL- 4 à capaz de reduzir as alteraÃÃes inflamatÃrias vistas na CH induzida por IFS. Para tanto, camundongos Swiss (25-30 g; n=6 por grupo) foram tratados com salina ou IFS (400 mg/kg, ip), e foram analisados por alteraÃÃes no peso Ãmido vesical (PUV), mudanÃas macroscÃpicas e microscÃpicas, alÃm da quantificaÃÃo de edema e hemoglobina vesical. Em outros grupos experimentais, IL- 4 (0,4; 2 ou 10 ng) foi administrada ip uma hora antes à administraÃÃo de IFS. Em outro experimento, camundongos C57BL/6 selvagens e C57BL/6 nocaute para o gene da IL- 4 (-/-) foram tratados com IFS e analisados quanto a mudanÃas no PUV. ImunohistoquÃmica para IL-1β e TNF-α, bem como identificaÃÃo de proteÃnas pela tÃcnica de Western blot para iNOS e COX-2 foram conduzidos nos animais tratados com IL- 4. TambÃm avaliou-se a administraÃÃo de soro anti-IL- 4 (50 Âl/animal, ip) em animais selvagens meia hora antes IFS. Nos animais tratados com IL- 4 (2 e 10 ng), o PUV foi significativamente reduzido em 27% e 39% respectivamente quando comparados ao grupo tratado apenas com IFS. O extravasamento vascular foi reduzido em 29% e 24% e a hemorragia em 47% e 61% nos animais tratados com IL- 4 (2 e 10 ng respectivamente para ambos). A administraÃÃo de IL- 4 exÃgena tambÃm atenuou a expressÃo de TNF-α, IL-1β significativamente, e a expressÃo de iNOS em 27% (dose de 10 ng) e COX-2 em 80% e 76% (doses de 2 e 10 ng, respectivamente), sendo ambos resultados significantes estatisticamente. Em adiÃÃo, animais nocaute para IL- 4 (-/-) e camundongos tratados com soro anti-IL- 4 exibiram um grau de CH pior quando comparados aos camundongos tratados com IFS apenas, em torno de 44% e 28% respectivamente. IL- 4, uma citocina antiinflamatÃria, pode reduzir os fenÃmenos inflamatÃrios vistos na CH induzida por IFS. / Hemorrhagic cystitis (HC) is a limiting side effect from the clinic use of chemotherapy agents, mainly cyclophosphamide (CYP) and ifosfamide (IFS). This is due to the fact that acrolein is a urinary metabolite of CYP and IFS, which has been demonstrated to be the causative agent of hemorrhagic cystitis (HC) induced by these compounds. Based on previous experimental studies, most of them from the Laboratory of Pharmacology of Inflammation and Cancer of Federal University of CearÃ, it was demonstrated the participation of inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1β, and the expression of iNOS and COX-2 in ifosfamide-induced HC. Thus, knowing that interleukin-4 (IL- 4) is an anti-inflammatory cytokine able to prevent the production of TNF-α, IL-1β, and decrease the expression of inflammatory enzymes such as iNOS and COX-2, we investigated whether IL- 4 is capable of reducing inflammatory changes seen with ifosfamide-induced HC. For this, male Swiss mice (25-30 g; 6 per group) were treated with saline or ifosfamide (400 mg/kg, intraperitoneally (ip) and analyzed by changes in bladder wet weight (BWW), macroscopic and microscopic parameters, exudate, and hemoglobin quantification. In other groups, IL- 4 (0,4; 2 or 10 ng) was administered ip 1h before ifosfamide administration. In other experimental groups, C57BL/6 WT (wild type) and C57BL/6 WT IL- 4 (-/-) knockout animals were treated with ifosfamide and analyzed for changes in BWW. Immunohistochemistry to TNF-α and IL-1β as well as protein identification by Western blot assay for iNOS and COX-2 were carried out on ifosfamide and IL- 4 treated animals. In other experimental groups, anti-IL- 4 serum was given (50 ÂL/animal, ip) 30 min before ifosfamide. In IL- 4 treated animals, BWW change was significantly less in animals treated with ifosfamide administration only, being reduced by 27% and 39% (2 and 10 ng respectively). Vascular permeability was reduced by 29% and 24%, and hemorrhage by 47% and 61% in those animals treated with IL- 4 (2 and 10 ng respectively). Exogenous IL- 4 also attenuated TNF-α, IL-1 β, iNOS and COX-2 expression on ifosfamide treated bladders. Moreover, knockout animals for IL- 4 (-/-) and animals treated with anti-IL- 4 serum exhibit a more severe degree of inflammation when compared to the wild type mice (approximately 44% and 28% respectively). IL- 4, an anti-inflammatory cytokine, can attenuate the inflammation seen with ifosfamide-induced hemorrhagic cystitis.

A famÃlia de receptores de potencial transitÃrio (TRP) incluindo o receptor de potencial transitÃrio anquirina, subtipo 1 (TRPA1) tem mostrado ser um alvo terapÃutico potencial para o tratamento da dor aguda e crÃnica. Alguns estudos tÃm demonstrado que a resposta nociceptiva somÃtica se deve à ativaÃÃo dos receptores TRPA1 e sÃo efetivamente modulados atravÃs da ferramenta experimental, HC-030031, um antagonista seletivo. Contudo, existem poucos estudos que avaliam o papel dos receptores TRPA1 na dor visceral. Portanto, investigamos o papel do TRPA1 em modelos animais de nocicepÃÃo visceral induzido por diferentes substÃncias e tambÃm exploramos os possÃveis mecanismos envolvidos. Camundongos Swiss, machos (N=6) receberam carboximetilcelulose 0,5% (veÃculo CMC 0,5%, 1 mL/Kg, v.o.), HC-030031 (75, 150 ou 300 mg/Kg, v.o.), ou L-NAME (10 e 40 mg/Kg, s.c.) ou somente L-Arginina (600 mg/Kg, i.p.), 1 h apÃs foi administrado uma Ãnica injeÃÃo de IFO (400 mg/Kg, i.p.). A nocicepÃÃo visceral foi avaliada atravÃs do teste de Von Frey eletrÃnico previamente (T0) e 12 h (T1) apÃs a injeÃÃo de IFO com estimulaÃÃo abdominal atravÃs de um analgesÃmetro digital. Os resultados foram obtidos em gramas (T0-T1) pela variaÃÃo da hiperalgesia. Em seguida as bexigas dos animais foram removidas para pesagem, anÃlise e foram atribuÃdos escores macro e microscopicamente. Investigou-se, tambÃm, o efeito antinociceptivo visceral do HC-030031 atravÃs do modelo de nocicepÃÃo visceral induzido por Ãleo de mostarda (OM). Os animais foram tratados com CMC 0,5%, HC-030031 (18,75; 37,5 ou 75 mg/kg, v.o.) ou Morfina (5 mg/Kg, s.c.) isoladamente ou receberam Naloxona (2 mg/Kg, i.p.) previamente a estas drogas. Em seguida, OM 0,75% (50 &#956;L/colon) foi instilado localmente no cÃlon. A nocicepÃÃo visceral foi verificada atravÃs do teste de Von Frey previamente (T0) e 10 min. (T1) apÃs a injeÃÃo do OM. Em outro protocolo experimental, os animais foram tratados com CMC 0,5% (10 mL/kg, v.o.) ou HC-030031 (18,75; 37,5 ou 75 mg/Kg, v.o.) previamente a uma injeÃÃo intraperitoneal com Ãcido acÃtico 0,6% (AA, 10 mL/Kg,), zymosan (Zym, 1 mg/cavidade) ou misoprostol (MPT, 1 Âg/cavidade, um anÃlogo estÃvel de prostaglandinas). Imediatamente apÃs a injeÃÃo desses algogÃnicos, contabilizaram-se as contorÃÃes abdominais por 30 min. Adicionalmente, para investigar o papel de cÃlulas peritoneais residentes sobre o efeito do HC-030031, a cavidade peritoneal dos camundongos foi lavada com uma soluÃÃo de 30 mL (PBS + heparina) e os estÃmulos AA, Zym e MPT foram injetados i.p. Um grupo Sham foi incluÃdo tambÃm neste protocolo. Ao final do experimento, as contorÃÃes abominais foram registradas por 30 mim. Utilizou-se para a anÃlise estatÃstica, ANOVA/Student e Newman/Keul, foi considerado significativo um p < 0,05 (CEPA: Protocolo: 92/10). A IFO induziu significativa (p<0,05) nocicepÃÃo visceral (6,25Â1,08) e resposta inflamatÃria [escores edema 2(1-3); hemorragia 3(1-3) e peso bexiga (42,78 3,10)] comparado com o grupo salina (1,97Â0,89),[ 0(0-0); 0(0-0) e 20,01 0,7749] respectivamente. AlÃm disso, HC-030031(75 mg/Kg) e L-NAME (10 e 40 mg/Kg) preveniram de maneira significativa (p<0,05) da resposta nociceptiva (2,30Â1,07; 1,58Â0,86 e 0,2500  0,73) respectivamente quando comparado com o grupo IFO. O prÃ-tratamento com L-Arginina (6,844Â1,235) reverteu o efeito antinociceptivo do L-NAME 10 mg/Kg, (6,84Â1,23), mas foi ineficaz sobre o efeito do L-NAME 40 mg/Kg (1,500Â0,7361) e HC-030031 75 mg/Kg (0,7200Â0,6953). Contudo, o prÃ-tratamento com HC-030031 nÃo apresentou efeito antiinflamatÃrio. Adicionalmente, verificou-se que o OM induziu significativo (p<0,05) comportamento nociceptivo (6,333Â0,9458) quando comparado ao grupo salina (1,250Â0,9204). AlÃm disso, o HC-030031 preveniu de maneira significativa da resposta nociceptiva provocada pelo OM (1,536 Â0,7653). Avaliou-se tambÃm o envolvimento do sistema opiÃide no efeito antinociceptivo do HC-030031. Verificou-se que a morfina apresentou uma importante atividade antinociceptiva (0,07143Â0,07143) contra a nocicepÃÃo induzida por OM a qual foi significativamente revertida pelo prÃ-tratamento com naloxona (3,125 1,302). Por outro lado, o efeito antinociceptivo do HC-030031 nÃo foi afetado pela naloxona (2,240Â1,263). Adicionalmente, AA, Zym e MPT induziram respostas de contorÃÃes abdominais significativas (43,71Â4,43; 11,00Â2,11 e 9,00Â2.30, respectivamente) as quais foram significativamente inibidas com HC-030031 (18,75, 37,5 ou 75 mg/kg, v.o.) em todas as doses utilizadas no teste com AA (29,07%; 53,35% e 41,59%), no teste com Zym (55,85%; 61,03% e 71,20%) e no teste com MPT (63,88%; 83,33% e 88,88%). Uma vez que a prostaglandina ativa o nociceptor diretamente, demonstrou-se que o HC-030031 possivelmente inibe a nocicepÃÃo visceral atravÃs da estabilizaÃÃo direta de nociceptores. O efeito antinociceptivo do HC-030031 parece ser independente da inibiÃÃo de cÃlulas residentes inflamatÃrias, do Ãxido nÃtrico ou do sistema opiÃide. Este estudo fornece perspectivas para o manuseio da dor visceral atravÃs da modulaÃÃo dos canais TRPA1. / The description of the TRP family of receptors including TRPA1 has provided potential therapeutic targets for treating acute and chronic pain. Some studies have shown a somatic nociceptive response due to the TRPA1 receptors activation which is effectively modulated with the experimental tool, HC-030031, a TRPA1 antagonist. However, there are a few studies evaluating the role of TRPA1 receptors in visceral pain. Then aimed to investigate the role of TRPA1 in the animal models of visceral nociception induced by different substances and to explore the possible mechanisms involved. Swiss male mice (n=6) were given only Carboxymethyl cellulose (vehicle CMC 0.5%, 1 mL/kg, p.o.), the compound HC-030031 (75, 150 or 300 mg/Kg, p.o.) or L-NAME (10 or 40 mg/Kg, s.c.) alone or with L-arginine (600mg/Kg, i.p.) 1h previously a alone injection of IFO (400 mg/kg, i.p.). Visceral nociception was assessed through the von Frey test previously (T0) and 12h (T1) later IFO injection by the abdominal stimulation with a pressure meter. The results were obtained in grams (T0-T1). The bladder of these animals were also removed to weighted (BWW), analyzed and after given scores macro and microscopically. We also investigated the antinociceptive effect of HC-030031 in the model of mustard oil-induced visceral nociception. The animals were treated with CMC 0.5% or HC-030031 (18.75, 37,5 or 75 mg/kg) or Morphine (5 mg/Kg, s.c.) alone or with Naloxone (2 mg/Kg, i.p.) 1h previously the injection of Mustard oil (MO) 0,75% (MO, 50 ul/colon). Visceral nociception was assessed through the von Frey test previously (T0) and 10 min (T1) after MO injection by the abdominal stimulation with a pressure meter. The results were obtained in grams (T0-T1). In another experimental setting, the animals were treated with CMC 0.5% (1 mL/kg, p.o) or HC-030031 (18.75; 37.5 or 75mg/Kg, p.o.) previously an intraperitoneal injection with acetic acid 0.6% (AA, 10 mL/kg), zymosan (Zym, 1 mg/cavity) or misoprostol (MPT, a stable prostaglandin analogous, 1&#956;g/cavity) and immediately had the writhing responses counted for 30 min. In order to investigate the role of resident peritoneal cells on the effect of HC-030031, we washed the peritoneal cavity of mice with heparin added PBS (30 mL) and then AA, Zym or MPT were injected i.p. A Sham group was included. Eventually, the writhing responses were recorded. Statistical analysis was performed with ANOVA/Student Newman Keul as appropriate. p<0.05 was accepted. (CEPA: Protocol 92/10). IFO induced significant (p<0.05) visceral nociception (6.25Â1.08) and inflammatory response [scores to edema 2(1-3); hemorrhage 3(1-3); and bladder wet weight (42.78  3.1)] in comparison with saline treated group (1.97Â0.89), [0(0-0); 0(0-0); 20.01 0.7749] respectively. Moreover, HC-030031(75) and L-NAME (10 or 40 mg/Kg) prevented in a significant manner (p<0.05) the nociceptive response (2.30Â1.07; 1.58Â0.860 and 2500Â0.7361) respectively when compared with IFO-treated group. Although the pretreatment with L-arginine (6.844Â1.235) was able to reverse the antinoceceptive effect of L-NAME 10 mg/Kg, (6.84Â1.23), it failed to do the same (p>0.05) with L-NAME 40 mg/Kg (1.500Â0.7361) and HC-0300031 75 mg/Kg (0.72Â0.69). The same reversible effect of L-Arginine was observed for the anti-inflammatory activity of L-NAME (p<0.05). However, HC-030031 presented no anti-inflammatory effect. The antinociceptive activity of HC-030031 was also assessed in the MO nociception model. We verified that MO induced a significant (p<0.05) nociceptive behavior (6.333Â0.9458) when compared to saline injected mice (1.250Â0.9204). Moreover, HC-030031 prevented in a significant manner the nociceptive response elicited by MO (1.536Â0.7653). Furthermore, the involvement of opioid system in the antinociceptive effect of HC-030031 as tested. We observed that morphine presented an important antinociceptive activity (0.07143Â0.07143) against MO-induced nociception which was significantly reverted by naloxone pre-treatment (3.125 1.302). On the other hand, the antinociceptive effect of HC-030031 remained in spite the injection of naloxone (2.240Â1.263). In addition to that, AA, Zym and MPT induced significant writhing responses (43.71Â4.43; 11.00Â2.11; 9.00Â2.30; respectively) which was significantly inhibited with HC-030031(18.75, 37.5 e 75 mg/kg, p.o.) treated mice in all the doses tested (29.07%, 53.35% and 41.59%, in the AA test, 55.85%, 61.03% and 71.20%, in the Zym test, 63.88%, 83.33% and 88.88%, in the MPT induced nociception, respectively to 18.75, 37.5 and 75 mg/kg doses. Eventually, the reduction of cell population in the peritoneal cavity prevented the development of writhing responses in both AA and Zym injected mice, with no effect was visualized on MPT treated mice. We the conclude that, since prostaglandin activates the nociceptor directly, it was shown that HC-030031 inhibits visceral nociception possibly through the stabilization of the neuronal ends. The antinociceptive effect of HC-030031 seems to be independent of the inhibition of inflammatory resident cells, opioid and nitric oxide pathways. This study provides perspective for the effective management of visceral pain through the modulation of TRPA1 channels.