Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi caracterizar a identificacao, o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, a similaridade genetica e os mecanismos de resistencia a trimetoprim/sulfametoxazol (SXT) entre os isolados clinicos do complexo Burkholderia cepacia (CBc). Metodologia: Foram avaliados 82 isolados clinicos do CBc recuperados de pacientes atendidos em dois hospitais universitarios localizados na regiao sudeste do Brasil. A identificacao bacteriana foi realizada pelo sequenciamento do gene recA e pela espectrometria de massas MALDI-TOF MS. O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos foi determinado para ceftazidima, cloranfenicol, levofloxacina, meropenem, minociclina, ticarcilina/acido clavulanico e SXT. Os resultados do perfil de sensibilidade tambem foram comparados entre quatro tecnicas distintas, microdiluicao em caldo, diluicao em agar, Etest e disco difusao, sendo a microdiluicao em caldo considerada a tecnica referencia. A concordancia geral e por categoria de sensibilidade, assim como as taxas de erros, foram calculadas de acordo com as recomendacoes do CLSI M23-A3. Os genes que conferem resistencia aos betalactamicos e ao SXT foram pesquisados por meio das tecnicas de PCR e sequenciamento dos respectivos amplicons. A similaridade genetica entre os isolados que carreavam genes de resistencia foi determinada por PFGE. O DNA plasmidial e cromossomal dos isolados foram extraidos utilizando as tecnicas de Kieser e kits comerciais, respectivamente. A localizacao dos genes de resistencia foi determinada por Southern blot e hibridizacao utilizando sondas especificas. O contexto genetico dos genes de resistencia encontrados entre os isolados do CBc foi determinado por PCR e sequenciamento das regioes conservadas 3ÆCS e 5ÆCS do integron de classe 1. A tecnica de conjugacao foi realizada utilizando como amostra receptora E.coli J53. Resultados: Foram identificadas, pelo sequenciamento do gene recA, B. cenocepacia (n=44), B. multivorans (n=12), B. vietnamiensis (n=10), B. contaminans (n=9) e B. cepacia (n=7). Comparando os resultados obtidos pelo recA com aqueles do MALDI-TOF MS, 100% e 75,6% dos isolados foram concordantes na identificacao ao nivel de genero e especie, respectivamente. Boas taxas de sensibilidade foram encontradas para ceftazidima (86,6%), meropenem (87,8%), minociclina (87,8%) e SXT (97,6%). A concordancia geral entre as tecnicas avaliadas foi maior que 93% entre microdiluicao em caldo e diluicao em agar, exceto para cloranfenicol (89%). Entre a tecnica referencia e os resultados obtidos pelo Etest, a concordancia geral foi maior que 92%, exceto para ceftazidima (78%), SXT (80,4%) e cloranfenicol (85,3%). A concordancia por categoria entre microdiluicao em caldo e disco difusao foi maior que 90% para a maioria dos antimicrobianos testados, exceto para cloranfenicol (52,4%), SXT (74,4%) e levofloxacina (83,3%). Dois isolados (B. cenocepacia e B. cepacia) apresentaram resistencia ao SXT e carreavam o gene dhfr22 inserido em um integron que classe 1. Entre os isolados resistentes a ceftazidima (7,3%), em apenas um (B. cenocepacia) foi detectado o gene blaOXA-10-like, tambem inserido em um integron de classe 1 o qual continha um gene cassete que confere resistencia aos aminoglicosideos, aadA1. De acordo com os resultados da hibridizacao, blaOXA-10-like estava inserido em um plasmideo de ~70 Kb. Entretanto, nao conseguimos realizar a transferencia deste plasmideo pela tecnica de conjugacao. Os dois isolados de B. cenocepacia que carreavam genes de resistencia apresentaram perfil clonal semelhante pelo PFGE. Conclusoes: O MALDI-TOF MS demonstrou ser uma excelente tecnica alternativa para a identificacao dos isolados do CBc. Boas taxas de sensibilidade foram observadas para os antimicrobianos usualmente empregados no tratamento das infeccoes causadas por estes micro-organismos. Em geral, foi observada boa concordancia entre as tecnicas de sensibilidade avaliadas neste estudo, exceto para as metodologias Etest e disco difusao na predicao da sensibilidade ao SXT. O gene dhfr22 demonstrou ser o principal mecanismo entre os isolados resistentes ao SXT. De acordo com os nossos conhecimentos, descrevemos, pela primeira vez, a presenca do gene blaOXA-10-like em um isolado clinico do CBc / FAPESP: 2012/04910-9 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-08T12:28:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 22.pdf: 1754861 bytes, checksum: 1ffad18e038e83070b6bf0ce1cc6f7d7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / O Sulfametoxazol (SMX) é um antibiótico de amplo espectro, pertencente à classe das sulfonamidas. Ele inibe competitivamente a enzima bacteriana diidropteroato-sintetase, enquanto a trimetoprima (TMP) é uma inibidora da diidrofolato-redutase. Ambas as drogas bloqueiam o metabolismo do ácido fólico produzindo uma atividade sinérgica antibacteriana. A associação é utilizada no tratamento de infecções bacterianas urinárias, das vias aéreas e de infecções oportunistas em portadores do vírus da imunodeficiência humana causadas por Pneumocystis jiroveci. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analítica para a avaliação da associação de SMX e TMP em comprimidos por eletroforese capilar de zona (CZE). Desenvolveu-se e validou-se o método utilizando capilar de sílica de 56 cm de comprimento efetivo e diâmetro de 75 µm, mantido à temperatura de 25 ºC com detecção por arranjo de diodos no comprimento de onda de 221 nm. Utilizou-se como eletrólito de corrida uma solução contendo tampão fosfato 15 mM, pH 6,2 e a diferença de potencial aplicada foi de 25 kV. O tempo de introdução da amostra foi de 15 segundos utilizando-se pressão de 45 mbar. O tempo de corrida foi de 10 minutos, com tempo de migração de aproximadamente 4 minutos para a TMP e 8 minutos para o SMX. A metodologia foi validada avaliando-se os parâmetros de linearidade, seletividade (efeito matriz e degradação acelerada), precisão, exatidão (procedimento de recuperação) e robustez. A faixa linear estabelecida na alíquota de análise para a TMP foi de 17 47 µg/mL e para o SMX foi de 100 220 µg/mL. O estudo do efeito matriz demonstrou que, para comprimidos de SMX e TMP, o método não apresenta efeito matriz. A precisão foi estudada pela repetitividade, precisão intermediária e reprodutibilidade. Os resultados da repetitividade apresentaram um valor HorRat de 0,510 para o SMX e 0,572 para a TMP, sendo o critério de aceitabilidade ≤ 2,0. / Sulfamethoxazole (SMX) is a broad-spectrum antimicrobial that belongs to a class of sulfonamide. It inhibits the bacterial enzyme dihydropteroate synthetase while trimethoprim (TMP) blocks the dihydrofolate reductase. Both drugs act synergistically and have a pronounced antibacterial activity, as they sequentially block two chemical reactions essential to bacterial survival. Clinically, the associated drugs are used to treat many kinds of infection caused by bacteria such as urinary infection, respiratory system infection and opportunistic infections in human immunodeficiency virus patients caused by Pneumocystis jiroveci. The aim of the present work was to develop and validate a capillary zone electrophoresis (CZE) method for the analysis of SMX and TMP in tablets. The CZE method was carried out on a silica capillary (56 cm effective length; 75µm internal diameter), maintained at 25ºC using photodiode array (PDA) detection at 221 nm. The running buffer consisted of 15 mM of phosphate buffer adjusted to pH 6.2 and the applied voltage was 25 kV. The time of sample introduction was 15 seconds using a pressure of 45 mbar. Under these conditions, the running time was 10 min with a migration time of 4 minutes for the TMP and 8 minutes for the SMX. The method was validated by evaluating the following parameters: linearity, selectivity (matrix effect and accelerated degradation), precision, recovery and robustness. The method was linear in the range of 100 - 220 µg/mL for SMX and 17 – 47 µg/mL for TMP, not presenting matrix effect. Precision was studied by repeatability, intermediate precision and reproducibility. Repeatability showed HorRat values of 0.510 for SMX and 0.572 for TMP, considering the acceptability criteria ≤ 2.0. The intermediate precision was evaluated on the basis of CV %, presenting 4,95 % and 5.03% for SMX and TMP, respectively. These values were considered satisfactory based on the acceptance criteria (less than 8%). The reproducibility showed a HorRat value of 1.25 for TMP, which is a value considered suitable based on the acceptance criteria (below 2.0). For SMX, the reproducibility HorRat value was 0.52 and the limit of acceptance was 2.0. Recovery range was 96.7 % to 97.6 % for SMX and 96.5 % to 102.4 % for TMP. The robustness was assessed by small and deliberate changes in the method parameters, observing slight variations in migration times. The proposed method can be applied to the quantitative analysis of SMX and TMP in tablets and can contribute for the improvement of the quality control of pharmaceutical products, reducing the use of organic solvents and waste generation, ensuring the safety and therapeutic efficacy of the formulations.