Lors des réponses immunitaires, le répertoire des lymphocytes B est diversifié par l’hypermutation somatique (HMS) et la commutation isotypique (CI), dépendant d’«activation-induced cytidine deaminase» (AID), qui introduit des lésions dans les gènes Ig. Une déficience d’AID cause un défaut d’HMS et de CI; par contre, une délétion du domaine C-terminal d’AID cause un défaut spécifique de la CI, suggérant que ce domaine interagit avec des facteurs spécifiques de la CI. Pour identifier ces facteurs, nous avons étudié une immunodéficience présentant un défaut de la CI non lié à la carence d’AID ni à un défaut d’HMS. De plus, les cassures de l’ADN ne sont pas détectées au niveau des gènes Ig suggérant qu’AID n’est pas correctement ciblée dans ces loci. Nous avons identifié et analysé des candidats : Spt6, les cohésines et le complexe Smc5/6. Dans les cellules B activées, AID interagit avec Spt6, Spt5, l’ARN polymérase II et le complexe PAF. Par contre, les cohésines pourraient réguler la structure du locus IgH lors de la CI et la voie de réparation des cassures de l’ADN générées pendant la CI. Ces résultats contribuent à une meilleure compréhension des étapes de la CI. / During immune responses, B cell repertoire is diversified through somatic hypermutation (SHM) and class switch recombination (CSR). SHM and CSR require activation-induced cytidine deaminase (AID), which induces DNA damage. While AID deficiency abrogates SHM and CSR, C-terminal truncations impair CSR without affecting SHM and it has been proposed that AID C-terminal domain associates with CSR-specific factor(s). In order to identify these factors, we studied a human CSR-specific immunodeficiency, characterized by normal SHM and AID expression. B cells from these patients do not display DSBs at switch (S) regions, suggesting that they might lack an AID-binding factor(s) required to target AID to S regions during CSR. Through a multi- approach strategy, we identified and analyzed candidate factors, including Spt6, the cohesin complex and the Smc5/6 complex. We show that, in B cells poised to undergo CSR, AID is in a complex with Spt6, Spt5, the RNA polymerase II and the PAF complex while cohesins might regulate the 3D structure of the IgH locus and the pathway of DSBs repair at the Ig S regions. Our work thus contributes to a better understanding of the CSR reaction.

Lors des réponses immunitaires, les lymphocytes B diversifient leur répertoire par l’hypermutation somatique (HMS) et la commutation isotypique (CI). Ces deux mécanismes sont dépendant de l’activité de « activation-induced cytidine deaminase » (AID), une enzyme qui déamine les cytosines de l’ADN en uraciles générant des mésappariements qui sont processés différemment dans le cas de l’HMS et de la CI. Au cours de la CI, le locus de la chaîne lourde des immunoglobulines subit un changement de conformation qui rapproche les promoteurs, les enhancers et les régions de switch afin de permettre la recombinaison des régions de switch. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents n’ont pas encore été identifié. Dans le but de comprendre les mécanismes de régulation d’AID, nous avons réalisé un criblage protéomique et identifié CTCF ainsi que les complexes médiateur et cohésine qui constituent des facteurs préalablement impliqués dans les interactions longues distances. Au cours de ce travail de thèse, nous avons montré que le complexe médiateur est requis pour la transcription de la région de switch acceptrice, pour l’interaction de cette dernière avec l’enhancer Eµ et pour le recrutement d’AID au locus des IgH. D’un autre côté, nous avons montré que le complexe cohésine est impliqué dans la réparation des cassures induites par AID et qu’il pourrait être impliqué dans la recombinaison des régions de switch. / During immune responses, B cells diversify their repertoire through somatic hypermutation (SHM) and class switch recombination (CSR). Both of these mechanisms are dependent on the activity of activation-induced cytidine deaminase (AID), an enzyme that deaminates cytosines into uracils generating mismatches that are differentially processed to result in SHM and CSR. During CSR, the Ig heavy chain (IgH) locus undergoes dynamic three-dimensional structural changes in which promoters, enhancers and switch regions are brought into close proximity. Nevertheless, little is known about the underlying mechanisms. To gain insight into the molecular mechanism responsible for AID regulation during CSR, we performed a proteomic screen for AID partners and identified CTCF, cohesin and mediator complexes, which are factors previously implicated in long-range interactions. We showed that during CSR, the mediator complex is required for acceptor switch region transcription, long-range interaction between the enhancer and the acceptor switch region and AID recruitment to the IgH locus whereas the cohesin complex is required for proper AID-induced breaks repair and might favor switch regions synapsis.

L’enzyme Activation-induced cytidine deaminase (AID) initie la diversification des immunoglobulines (Ig) par l’induction de dommages à l’ADN. Alors que les lésions induites aux gènes des Ig sont cruciales pour l’établissement de réponses immunes hautement spécifiques et adaptées, ce même type de lésions provoquées ailleurs dans le génome contribue à la transformation cellulaire et à l’apparition de cancer. Les mécanismes impliqués dans la protection de l’intégrité génomique des cellules B restent à définir. D’une part, nous avons développé une approche de protéomique locus-unique en couplant une technique d’identification de protéine par biotinylation de proximité avec l’outil d’édition du génome CRISPR/Cas9. Cette technique innovante, dont nous avons fait la preuve de principe pour des loci abondants, pourra être utilisée pour identifier le protéome des différentes cibles génomiques d’AID. D’autre part, nous avons caractérisé le rôle de Parp3, Parp9 et Med1, identifiées comme partenaires d’AID, éclairant ainsi les mécanismes qui contrôlent l’activité d’AID et la réparation des lésions induites par AID lors de la diversification des Ig. / Activation-induced cytidine deaminase (AID) initiates immunoglobulin (Ig) diversification by inducing DNA damage. While on-target lesions are crucial for mounting highly specific and adaptive immune responses, off-target lesions contribute to malignant cell transformation. Despite its implications, the events following AID recruitment that enforce genome integrity in B cells remain poorly defined. It is not understood why multiple non-Ig loci bound by AID are not mutated or why AID-induced DNA lesions may lead to mutations or DNA breaks. To address this question, we developed a single-locus proteomic approach coupling proximity-dependent protein identification and genome editing (CRISPR/Cas9) to identify and compare the proteins recruited at individual genomic loci bound by AID. We performed the proof of principle of this innovative tool by identifying the proteome of abundant genomic loci. On the other hand, we functionally characterized Parp3, Parp9 and Med1, identified as AID partners, revealing novel mechanisms that tightly control AID activity and DNA repair during Ig diversification.