En milieu marin le carbone organique particulaire (POC) représente 25 % du carbone organique total. Sa dégradation est réalisée par des microorganismes hétérotrophes ayant mis en place diverses stratégies pour parvenir à le dissoudre et l’assimiler. Peu d’études se sont intéressées à la dégradation des composés polymériques et/ou hydrophobes, quasiment insolubles dans l’eau constituant le POC. Parmi ces composés, on retrouve les lipides et les hydrocarbures regroupés sous le terme de COH (composés organiques hydrophobes). La dégradation des COH est réalisée par des bactéries dîtes oléolytiques ayant entre autre pour stratégie la formation de biofilms également qualifiés d’oléolytique. Nos connaissances sur la diversité et la fonctionnalité des biofilms oléolytiques se limitent actuellement aux bactéries spécifiquement étudiées pour leur capacité à dégrader les HC. Ainsi la dégradation des lipides est souvent négligée alors que cette famille de molécules représente une part significative du POC.La diversité taxonomique des bactéries formant des biofilms oléolytiques a été déterminée par un criblage de 199 souches marines sur 4 substrats : un alcane (paraffine), un triglycéride (tristéarine), un acide gras (acide palmitique) et une cire (l’hexadécyl palmitate). Cette étude a révélé que les bactéries oléolytiques (formant un biofilm sur au moins 1 des substrats) sont relativement répandues parmi les bactéries marines puisque qu’elles représentent 18.7 % des souches testée. Cette étude montre également que les bactéries capables d’assimiler les alcanes sont également capables d’assimiler au moins un lipide. Les bactéries hydrocarbonoclastes, jusqu’alors décrites comme spécialisées, voir restreintes à l’assimilation des hydrocarbures, présentent donc une gamme de substrats s’étendant aux lipides. La corrélation positive entre la capacité d’assimilation des alcanes et l’assimilation des lipides suggère un lien physiologique entre l’assimilation de ces deux familles de COH. L’activité lipase qui est essentielle à l’assimilation des triglycérides mais pas à l’assimilation des alcanes, a été mesurée dans des cultures de souches oléolytiques poussant sur acétate, triglycéride ou hexadécane. Comme attendu, les cultures sur triglycérides montrent toutes une surexpression de l’activité lipases par rapport aux cultures sur acétate. Les cultures sur hexadécane montraient aussi une surexpression de l’activité lipase renforçant l’idée d’un lien physiologique entre dégradation des alcanes et dégradation des lipides. De plus les souches oléolytiques n’ont pas montré de capacité à former un biofilm sur une surface inerte hydrophobe telle que le polystyrène ou sur une surface hydrophile telle que le verre à la hauteur de celles constaté sur COH. Une étude quantitative de l’adhésion sur COH et substrats inertes réalisée par microscopie montre que l’adhésion (dans les conditions testées) n’est pas un facteur déterminant de la formation de biofilm sur ces mêmes substrats. Cela suggère que la spécificité de formation de biofilm sur les substrats COH, ne réside pas dans l’adhésion mais vraisemblablement dans les étapes de développement du biofilm plus tardives.Enfin, les biofilms oléolytiques mettant en jeux des produits extracellulaires (enzymes et facteurs de solubilisation) qui constituent des biens communs, sont propices à l’établissement de comportements sociaux. Nous avons mis en évidence des comportements synergiques (5/8 des comportements observés) ou compétitifs au sein de biofilm oléolytiques (3/8 des comportements observés). / Particulate organic carbon (POC), in marine environment, accounts for 25% of total organic carbon. POC degradation is carried out by heterotrophic microorganisms which have developed strategies to dissolve and assimilate it. Few studies have investigated the degradation of the polymeric and / or hydrophobic components of POC, which are almost insoluble in the water. Among these compounds, there are lipids and hydrocarbons (HC) grouped under the term of HOCs (hydrophobic organic compounds). The degradation of the HOCs is carried out by oleolytic bacteria which form biofilms at the HOC– water interface. Our knowledge of the diversity and functionality of oleolytic biofilms is mostly limited to HC degrading bacteria, while the degradation of lipids is often neglected although this family of molecules represents a significant part of the POC. A screening of 199 marine strains on 4 substrates: an alkane (paraffin), a triglyceride (tristearin), a fatty acid (palmitic acid) and a wax ester (hexadecyl palmitate) was performed to determine the taxonomic diversity of bacteria able to form oleolytic biofilms. This study revealed that oleolytic bacteria (forming a biofilm on at least 1 substrate) were relatively widespread among marine bacteria since they represented 18.7% of tested strains. This study also showed that bacteria able to assimilate alkanes were also able to assimilate at least one lipid. Hydrocarbonoclastic bacteria, previously described as specialized, or restricted to the assimilation of hydrocarbons, have actually a substrate range spanning from HC to lipids. The positive correlation between the ability to form a biofilm on alkanes and on lipids suggested a physiological link between the assimilation of these two HOC families. The lipase activity, which is essential for triglycerdides assimilation but not for the alkanes assimilation, was measured in oleolytic strains cultures growing on acetate, triglyceride or hexadecane. As expected, overexpression of lipase activity was observed in cultures on triglycerides compared to cultures on acetate. Moreover, overexpression of lipase activity was also observed in cultures on hexadecane reinforcing the idea of a physiological link between alkanes and lipids degradation.Oleolytic strains exhibited a very weak ability to form a biofilm on the inert surfaces (non-nutritive) polystyrene or glass compared to the HOC nutritive surface indicating that oleolytic strains have a specificity for HOC to form a biofilm. A quantitative study of adhesion on HOC and inert substratums carried out by microscopy shows that adhesion (in the tested conditions) is not a determining factor of the biofilm formation on these same substrates. This suggests that the specificity of biofilm formation on HOC substrates does not reside in adhesion but presumably in later biofilm development stages.Lastly, oleolytic biofilms, involving extracellular products (enzymes and solubilization factors) that constitute public goods, are favorable to the establishment of social behaviors. We have demonstrated synergistic behaviors (5/8 of observed behaviors) or competitive behaviors (3/8 of observed behaviors) in oleolytic biofilms.

Les composés organiques hydrophobes (HOCs), lipides et hydrocarbures, représentent une part significative de la matière organique dans l’environnement marin. Leur faible solubilité dans l’eau exige de la part des bactéries qui les dégradent des adaptations physiologiques permettant de stimuler leur transfert de masse de la phase organique vers la phase aqueuse où ils sont assimilés. La formation de biofilm à l’interface HOC-eau est l’une de ces adaptations. La bactérie marine Marinobacter hydrocarbonoclasticus (Mh), qui est capable d’utiliser un catalogue assez large de HOCs comme les alcanes, les alcools gras et les triglycérides, a été utilisée comme modèle d’étude de la formation de biofilms aux interfaces HOCs-eau. Le but de mes recherches était de : (i) mener la caractérisation fonctionnelle des gènes aupA et aupB, qui sont surexprimés en condition de biofilm sur hexadécane et (ii) dresser, par une étude de transcriptomique, une liste de gènes potentiellement impliqués dans l’adhésion et la formation de biofilm aux interfaces HOCs-eau dans le but d’appréhender les mécanismes moléculaires mis en jeu. L’étude fonctionnelle de aupA et aupB a révélé que ces deux gènes forment un opéron dont l’expression est activée par divers types de HOCs. Il a aussi été démontré qu’ils sont impliqués dans le transport de l’hexadécane et dans la formation de biofilm sur alcanes. La protéine AupA est localisée dans la membrane externe de Mh et AupB, une lipoprotéine présumée, est située dans la membrane interne. AupA appartient à une sous-famille de transporteurs FadL-like, spécifique des bactéries marines hydrocarbonoclastes (HCB). La distribution phylogénétique de l'opéron aupAB limitée aux bactéries marines ayant la capacité de dégrader les alcanes et sa présence en nombreuses copies chez certaines souches d’Alcanivorax sp. suggèrent fortement que les protéines Aup joueraient un rôle primordial dans l’adaptation des HCB à l’utilisation d’alcanes comme sources de carbone et d’énergie. L’analyse transcriptomique des cellules de Mh adhérées (après 15 min ou 3 h de contact) ou formant un biofilm aux interfaces HOCs-eau a révélé une modification importante et précoce de leur transcriptome. De nombreux gènes intervenant dans le métabolisme des HOCs, la production de polysaccharides, la synthèse d’acides aminés et de protéines ribosomales présentent une expression modulée dès 15 min d’adhésion. La surexpression des gènes de flagelle et du chimiotactisme conjointement avec celle de gènes de pili en condition d’adhésion évoquent une possible mobilité des cellules de Mh à l’interface dans les étapes précoces du développement du biofilm. De plus, il semblerait que le facteur de transcription RpoN soit impliqué dans la régulation de la formation de biofilm chez Mh et que les prophages puissent intervenir dans la structure et/ou la dispersion du biofilm. Enfin, le rôle potentiel d’un îlot génomique dans la formation de biofilm sur trioléine a été suggéré. / Hydrophobic organic compounds (HOCs), such as lipids and hydrocarbons, represent a significant part of the organic matter in the marine environment. Their low solubility in water requires from bacteria that degrade them physiological adaptations to stimulate their mass transfer from the organic to the aqueous phase where they are assimilated. Biofilm formation at the HOC-water interface is one of those adaptations. The marine bacterium Marinobacter hydrocarbonoclasticus (Mh) which is able to use a broad range of HOCs such as alkanes, fatty alcohols and triglycerides, was used as a model to study the biofilm formation at HOCs-water interfaces. The aim of my research was to (i) conduct the functional characterization of aupA and aupB genes which are overexpressed in biofilm on hexadecane, (ii) draw up a list of genes, through a transcriptomic study, that are potentially involved in adhesion and biofilm formation at HOCs-water interfaces in order to understand the molecular mechanisms involved.Functional study of aupA and aupB revealed that these two genes form an operon whose expression is activated by various types of HOCs. They have also been shown to be involved in the transport of hexadecane and in biofilm formation on alkanes. The AupA protein is localized in the outer membrane and the predicted lipoprotein AupB is located at the inner membrane. AupA belongs to a subfamily of the FadL-like transporters, specific to marine hydrocarbonoclastic bacteria (HCB). The phylogenetic distribution of the aupAB operon restricted to marine bacteria having the ability to degrade alkanes and its presence in multiple copies in somestrains of Alcanivorax sp. strongly suggest that Aup proteins play a key role in the adaptation of HCB to use alkanes as carbon and energy sources. The transcriptomic analysis of Mh cells adhering (after 15 min or 3 h of contact) or forming a biofilm at HOCs-water interfaces revealed significant and early changes in their transcriptome. The expression of many genes involved in the metabolism of HOCs, polysaccharides production, amino acids and ribosomal proteins synthesis is modulated as early as 15 min of adhesion. The overexpression of flagella and chemotaxis genes together with that of pili in adhesion condition suggest a possible motility at the interface during the early stages of biofilm development. In addition, it appears that the transcription factor RpoN is involved in the regulation of biofilm formation in Mh and that prophages could play a role in the structure and/or dispersal of the biofilm. Finally, a potential role of a genomic island in biofilm formation ontriolein was suggested

Les composés organiques hydrophobes (HOC), une grande famille de molécules naturelles ou d’origine anthropique incluant les lipides et les hydrocarbures, constituent une part significative de la matière organique dans les écosystèmes marins. Du fait de leur faible solubilité dans l’eau, les bactéries qui les dégradent requièrent la mise en place de fonctions cellulaires spécifiques permettant d’augmenter la fraction assimilable de ces HOC. La formation de biofilms à l’interface eau-HOC est une de ces stratégies adaptatives. C’est le cas pour Marinobacter hydrocarbonoclasticus SP17, modèle d’étude utilisé au laboratoire, qui est capable de former des biofilms sur un large spectre de HOC métabolisables tels que les alcanes, les triglycérides et les alcools gras. Le but de mes recherches consistait à améliorer la compréhension du processus d’adhésion et de développement des biofilms sur les HOC, à travers la caractérisation fonctionnelle de 10 gènes candidats mis en évidence lors d’analyses d’expression en protéomique et en transcriptomique. Pour mener à bien ce projet, des outils génétiques et une caractérisation fonctionnelle propre à chaque gène ont dû être développés. L’étude fonctionnelle du gène MARHY2686 a relevé son implication dans la formation de biofilm sur les alcanes. La co-expression de MARHY2686 et des gènes adjacents MARHY2687 et MARHY2685 en transcriptomique, leur distribution phylogénétique et leur conservation de la synthénie suggèreraient que ces trois gènes soient impliqués dans le même processus biologique. D’après l’identité forte de 36 % qui existe entre la protéine MARHY2686 et une protéine périplasmique AdeT d’un système de pompe d’efflux tripartite d’Acinetobacter baumanii, cette protéine, en association avec MARHY2687 et MARHY2685, pourrait faire partie d’un système de ce type. Par ailleurs, des observations ont permis d’envisager une implication potentielle de ce gène dans l’assimilation des HOC ou dans l’accumulation des réserves lipidiques intracellulaires. M. hydrocarbonoclasticus SP17 utilise les pili de type IV lors de la formation de biofilm sur les HOC. Ces appendices interviennent lors de l’adhésion de cette souche à des HOC ainsi que dans un processus de détachement d’un support hydrophobe. Les pili pourraient soit intervenir directement pour permettre à la bactérie de se détacher de la surface à laquelle elle s’est adhérée, soit indirectement par l’action de bactériophages. La présence d’une mobilité de type twitching sur les HOC a pu être également envisagée. Enfin, le rôle du système de sécrétion de type VI (T6SS), connu pour permettre à la bactérie d’interagir avec une cellule hôte, lors de la formation de biofilm mono-spécifique sur HOC, où aucun autre microorganisme que M. hydrocarbonoclasticus SP17 n’est présent, a été étudié. / Hydrophobic organic compounds (HOC), a large family of naturally-produced or anthropogenic molecules including lipids and hydrocarbons, represent a significant part of organic matter in marine ecosystems. Because of their low solubility in water, bacteria that degrade those compounds require the establishment of specific cell functions to increase their biodisponibility. Biofilm formation in water-HOC interface is one of these adaptations. The model of bacteria used in our laboratory, Marinobacter hydrocarbonoclasticus SP17, is able to form a biofilm on a wide range of HOC, such as alkanes, fatty alcohols and triglycerides, in order to use them as a carbon and energy source. The main purpose of my work was to broaden the knowledge of how bacteria adhere to and from biofilms on HOC, through the functional characterization of 10 candidate genes highlighted during proteomic and transcriptomic studies. Genetic tools and a gene-specific functional characterization have been developed in order to carry out this project. Functional study conducted on MARHY2686 revealed its involvement in the formation of biofilm on alkanes. Co-expression of MARHY2686 and the adjacent genes MARHY2687 and MARHY2685 durnig transcriptomic analysis together with their phylogenetic distribution and synteny conservation suggest that these three genes are involved in the same biological process. According to the high peptide sequence identity between MARHY2686 and AdeT, a periplasmic protein of a tripartite efflux pump system of Acinetobacter baumanii, MARHY2686 in combination with MARHY2687 and MARHY2685 could be the components of such a system. Other phenotypic observations would consider the involvement of MARHY2686 either in the assimilation of HOC or in the accumulation of intracellular lipid reserves. M. hydrocarbonoclasticus SP17 uses type IV pili during biofilm formation on HOC. These appendages are involved in the adhesion of this strain to and in a detachment process from HOC. Type IV pili could either act directly to allow bacteria to detach from the surface to which it is adhered, or indirectly through the action of bacteriophages. The presence of twitching motility on HOC has also been suggested. Finally, the role of the type VI secretion system (T6SS), a well-known protein system which allows interactions between bacteria and host cells, during the formation of a mono-species biofilm on HOC where no other microorganism than M. hydrocarbonoclasticus SP17 is present, has been studied.