Submitted by LÍDIA DE AZEVEDO DUARTE null (lazevedoduarte@yahoo.com) on 2016-07-04T15:36:55Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Lídia de Azevedo Duarte.pdf: 2363305 bytes, checksum: efa260f700d1944dbbb8f78e537f82bb (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido não contém a folha de aprovação. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. 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Agradecemos a compreensão. on 2016-07-07T19:13:57Z (GMT) / Submitted by LÍDIA DE AZEVEDO DUARTE null (lazevedoduarte@yahoo.com) on 2016-07-08T03:10:48Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Lídia Duarte 2.pdf: 2427239 bytes, checksum: 42c587d0dec38f33c9746c78a8b45621 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-07-12T13:59:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 duarte_la_me_rcla.pdf: 2427239 bytes, checksum: 42c587d0dec38f33c9746c78a8b45621 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-12T13:59:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 duarte_la_me_rcla.pdf: 2427239 bytes, checksum: 42c587d0dec38f33c9746c78a8b45621 (MD5) Previous issue date: 2016-06-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A alta atividade industrial e a utilização do petróleo como principal recurso energético atual são alguns dos fatores que colaboram com a frequente liberação dos produtos petroquímicos no ambiente. Ambientes marinhos são suscetíveis à contaminação por petróleo devido à sua estreita relação com as indústrias petrolíferas e micro-organismos derivados desses ambientes possuem potencial para atuar na biorremediação sob estas condições. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi analisar a detoxificação e degradação de amostras de petróleo bruto e óleo diesel, a partir da estruturação de dez consórcios microbianos compostos pelos seguintes micro-organismos em combinações variadas: quatro fungos ligninolíticos (basidiomicetos e não basidiomicetos) isolados de invertebrados marinhos, duas bactérias isoladas de reservatório de petróleo (off-shore), duas leveduras lipolíticas marinhas da Antártica e um fungo marinho lipolítico da costa brasileira. A avaliação da detoxificação dos compostos estudados foi realizada por meio da análise de toxicidade aguda em Microtox (Vibrio fischeri) e com o microcrustáceo Artemia sp. O consórcio constituído pelos micro-organismos Aspergillus sclerotiorum CBMAI 849, Cladosporium cladosporioides CBMAI 857, Bacillus sp. CBMAI 707 e Cryptococcus laurentii CRM 707, se destacou com 46% e 60% de sobreviventes de Artemia sp. quando incubado por 21 dias com óleo diesel e petróleo, respectivamente. Estes resultados corroboraram com os dados do microtox, que mostrou uma diminuição da toxicidade quando incubado com diesel, justificando a seleção deste consórcio para prosseguir nas etapas posteriores do trabalho. O planejamento experimental permitiu determinar condições ótimas de temperatura e agitação para o consórcio selecionado, o qual foi posteriormente submetido a dois planejamentos do tipo Plackett–Burman e os melhores ensaios obtidos foram validados experimentalmente. Os ensaios de validação confirmaram o potencial do consórcio na detoxificação dos poluentes estudados e o planejamento experimental possibilitou aumentar a concentração do diesel e utilizar apenas extrato de malte como fonte de carbono adicional, reduzindo o custo do processo. Para o petróleo, houve bons resultados com incubação a 7 dias, mostrando a possibilidade de redução do tempo de ensaio. Não foi detectada atividade de lacase, Manganês Peroxidase e Lignina Peroxidase nos ensaios de validação. A atividade de lipase foi maior nos ensaios com petróleo e óleo diesel do que na ausência destes, indicando que houve indução da atividade enzimática pelos poluentes. A análise de CG/EM mostrou mudanças na no perfil cromatográfico do petróleo e do óleo diesel após a incubação com os micro-organismos. Os resultados do presente trabalho destacam a relevância de micro-organismos de ambientes marinhos na detoxificação de poluentes ambientais e estimula novos estudos envolvendo a aplicação de consórcios microbianos marinhos na biorremediação, as enzimas envolvidas no processo e a avaliação da expressão gênica, por meio de estudos de metatranscriptômica. / The high industrial activity and the use of petroleum as the current primary energy resource are some of the factors that contribute to the release of petrochemical products in the environment. Marine environments are susceptible to contamination by petroleum due to its close relationship with the oil industry. Micro-organisms derived from these environments have the potential to act in bioremediation under these conditions. Thus, the aim of this study was to analyze the detoxification and degradation of crude oil and diesel samples by ten microbial consortia composed with the following microorganisms in combinations: four ligninolytic fungi (basidiomycetes and not basidiomycetes) isolated from marine invertebrates, two isolated from oil reservoir (off-shore), two marine lipolytic yeast from Antarctic and a marine lypolitic fungus from the Brazilian coast. The evaluation of detoxification was performed by acute toxicity analysis with Microtox (Vibrio fisheri) and the microcrustacean Artemia sp. The consortium composed by Aspergillus sclerotiorum CBMAI 849, Cladosporium cladosporioides CBMAI 857, Bacillus sp. CBMAI 707 e Cryptococcus laurentii CRM 707, showed 46% and 60% of Artemia sp. survivors after incubation for 21 days with diesel oil and petroleum, respectively. These results corroborate the microtox data, which showed a decrease in toxicity when incubated with diesel, justifying the selection of this consortium to the next steps of the study. The experimental design allowed us to determine optimal conditions of temperature and agitation to the selected consortium. Two Plackett-Burman experiments were carried out and the best assays were validated experimentally. Validation tests confirmed the potential of the consortium to detoxifify the pollutants. The experimental design enabled the increasing in diesel concentration and the use of only malt extract as additional source, reducing the cost of the process. For petroleum, results after 7 days of incubation showed the possibility of reducing the treatment time. Laccase, Manganese Peroxidase and Lignin Peroxidase activities were not detected in the validation experiments. The lipase activity was higher in the assays with petroleum and diesel oil in comparison with the assays without the pollutants, indicating that there was an induction on the enzymatic activity by the pollutants. The GC/MS analysis showed changes in the chromatographic profiles of petroleum and diesel oil after incubation with the micro-organisms. Results from the presente work, highlight the relevance of marine-derived micro-organisms in the detoxification of environmental pollutants and stimulate new studies in the field of marine consortium application, the enzymes involved in the process and the evaluation of gene expression by using metatranscriptomic approach. / FAPESP: 2014/13205-2

Nostoc é um gênero cianobacteriano com distribuição ubíqua que tem importância em diversos ecossistemas. Contudo, poucos genomas estão atualmente disponíveis para esse gênero. Enquanto Nostoc spp. são as cianobactérias mais comumente relatadas em relações simbióticas com fungos, animais, plantas e outros organismos, associações com outros micro organismos não receberam atenção similar. Como consequência das fortes interações entre cianobactérias e heterótrofos, culturas não axênicas são geralmente obtidas no isolamento dessas bactérias, o que proporciona uma oportunidade interessante para o desenvolvimento tanto de estudos genômicos quanto metagenômicos. Este trabalho teve como objetivo investigar as características genômicas e funcionais da linhagem Nostoc sp. CENA67, isolada de terra preta antropogênica, bem como estudar sua comunidade associada. Para esse fim, células de uma cultura não axênica de Nostoc sp. CENA67 foram sequenciadas com as plataformas MiSeq e Ion PGM e analisados com ferramentas genômicas e metagenômicas. A linhagem CENA67 de fato pertence à família Nostocaceae e possui algumas características em comum com cianobactérias do gênero Nostoc, porém diverge em certos aspectos morfológicos e filogenéticos do grupo típico de Nostoc, sugerindo que seja representante de um novo táxon. Além disso, seu genoma apresenta diferenças em relação aos genomas atualmente disponíveis para cianobactérias relacionadas ao gênero. A mineração desse genoma revelou 31 agrupamentos gênicos hipoteticamente relacionados à síntese de metabólitos secundários, a maioria dos quais não mostrou similaridade significativa com agrupamentos conhecidos. A análise de um agrupamento gênico de microviridina desvendou uma maior diversidade de genes para precursores dessa molécula do que se acreditava anteriormente, sugerindo que um número considerável de variantes ainda está a ser descoberta. A análise taxonômica da comunidade associada confirmou a dominância de cianobactérias na cultura, mas também revelou a presença de grande número de gêneros microbianos que normalmente são capazes de fixar nitrogênio atmosférico e estabelecer simbiose com plantas, incluindo Mesorhizobium, Sinorhizobium e Starkeya, entre outros. Rascunhos genômicos foram obtidos para Bradyrhizobium diazoefficiens, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia lata e Hyphomicrobium nitrativorans. Todavia, genes para fixação de nitrogênio não foram detectados nesses genomas, apesar de serem encontrados no genoma da cianobactéria e no metagenoma da comunidade, o que sugere que algumas populações podem estar sob pressão de seleção para a perda da capacidade de fixação de nitrogênio, provavelmente devido a este nutriente estar sendo fornecido pelo organismo mais abundante nesta comunidade, a cianobactéria. A análise funcional indicou vias exclusivas tanto à cianobactéria quanto à comunidade associada, e sugeriu a complementariedade de certos metabolismos. Os resultados possibilitam o aumento do conhecimento sobre a diversidade molecular e química do filo Cyanobacteria e levantam possíveis interações com micro organismos simbiontes / Nostoc is a cyanobacterial genus with ubiquitous distribution that is important in several ecosystems. However, few genomes are currently available for this genus. While Nostoc spp. are the most commonly reported cyanobacteria in symbiotic relationship with fungi, animals, plants, and other organisms, associations with other microorganisms have not received similar attention. As a consequence of tight interactions between cyanobacteria and heterotrophs, non-axenic cultures are usually achieved in the isolation of these bacteria, which provides an interesting opportunity for carrying out both genomic as metagenomic studies. This work aimed to investigate the genomic and functional characteristics of the strain Nostoc sp. CENA67, isolated from anthropogenic dark earth, and to study its associated community. For this purpose, cells from a non-axenic culture of Nostoc sp. CENA67 were sequenced with the platforms MiSeq and Ion PGM and analyzed with genomic and metagenomic tools. The strain CENA67 indeed belongs to the family Nostocaceae and presents some characteristics in common with cyanobacteria of the genus Nostoc, but diverges in certain morphological and phylogenetic aspects of the typical Nostoc group, suggesting that it is a representative of a new taxon. In addition, its genome presents differences in relation to the genomes currently available for cyanobacteria related to this genus. Genome mining revealed 31 gene clusters hypothetically related to the synthesis of secondary metabolites, most of which did not show significant similarity to known clusters. The analysis of a microviridin gene cluster unveiled a larger diversity of precursor genes for this molecule than was previously believed, suggesting that a considerable number of variants is still to be found. The taxonomic analysis of the associated community confirmed the dominance of cyanobacteria in the culture, but also revealed the presence of a great number of microbial genera that are usually capable of fixing atmospheric nitrogen and establishing symbiosis with plants, including Mesorhizobium, Sinorhizobium, and Starkeya, among others. Genomic drafts were obtained for Bradyrhizobium diazoefficiens, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia lata, and Hyphomicrobium nitrativorans. Nevertheless, genes for nitrogen fixation were not detected in these genomes, despite being found in the cyanobacterial genome and the community metagenome, suggesting that some populations might be under selection pressure for the loss of the ability to fix nitrogen, probably due to this nutrient being provided for the most abundant organism in this culture, the cyanobacterium. Functional analysis indicated pathways exclusive both to the cyanobacterium as to the associated community, and suggested the complementarity of certain metabolisms. The results allow the increase of the knowledge about the molecular and chemical diversity of the phylum Cyanobacteria and raise possible interactions with symbiotic microorganisms

Nostoc é um gênero cianobacteriano com distribuição ubíqua que tem importância em diversos ecossistemas. Contudo, poucos genomas estão atualmente disponíveis para esse gênero. Enquanto Nostoc spp. são as cianobactérias mais comumente relatadas em relações simbióticas com fungos, animais, plantas e outros organismos, associações com outros micro organismos não receberam atenção similar. Como consequência das fortes interações entre cianobactérias e heterótrofos, culturas não axênicas são geralmente obtidas no isolamento dessas bactérias, o que proporciona uma oportunidade interessante para o desenvolvimento tanto de estudos genômicos quanto metagenômicos. Este trabalho teve como objetivo investigar as características genômicas e funcionais da linhagem Nostoc sp. CENA67, isolada de terra preta antropogênica, bem como estudar sua comunidade associada. Para esse fim, células de uma cultura não axênica de Nostoc sp. CENA67 foram sequenciadas com as plataformas MiSeq e Ion PGM e analisados com ferramentas genômicas e metagenômicas. A linhagem CENA67 de fato pertence à família Nostocaceae e possui algumas características em comum com cianobactérias do gênero Nostoc, porém diverge em certos aspectos morfológicos e filogenéticos do grupo típico de Nostoc, sugerindo que seja representante de um novo táxon. Além disso, seu genoma apresenta diferenças em relação aos genomas atualmente disponíveis para cianobactérias relacionadas ao gênero. A mineração desse genoma revelou 31 agrupamentos gênicos hipoteticamente relacionados à síntese de metabólitos secundários, a maioria dos quais não mostrou similaridade significativa com agrupamentos conhecidos. A análise de um agrupamento gênico de microviridina desvendou uma maior diversidade de genes para precursores dessa molécula do que se acreditava anteriormente, sugerindo que um número considerável de variantes ainda está a ser descoberta. A análise taxonômica da comunidade associada confirmou a dominância de cianobactérias na cultura, mas também revelou a presença de grande número de gêneros microbianos que normalmente são capazes de fixar nitrogênio atmosférico e estabelecer simbiose com plantas, incluindo Mesorhizobium, Sinorhizobium e Starkeya, entre outros. Rascunhos genômicos foram obtidos para Bradyrhizobium diazoefficiens, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia lata e Hyphomicrobium nitrativorans. Todavia, genes para fixação de nitrogênio não foram detectados nesses genomas, apesar de serem encontrados no genoma da cianobactéria e no metagenoma da comunidade, o que sugere que algumas populações podem estar sob pressão de seleção para a perda da capacidade de fixação de nitrogênio, provavelmente devido a este nutriente estar sendo fornecido pelo organismo mais abundante nesta comunidade, a cianobactéria. A análise funcional indicou vias exclusivas tanto à cianobactéria quanto à comunidade associada, e sugeriu a complementariedade de certos metabolismos. Os resultados possibilitam o aumento do conhecimento sobre a diversidade molecular e química do filo Cyanobacteria e levantam possíveis interações com micro organismos simbiontes / Nostoc is a cyanobacterial genus with ubiquitous distribution that is important in several ecosystems. However, few genomes are currently available for this genus. While Nostoc spp. are the most commonly reported cyanobacteria in symbiotic relationship with fungi, animals, plants, and other organisms, associations with other microorganisms have not received similar attention. As a consequence of tight interactions between cyanobacteria and heterotrophs, non-axenic cultures are usually achieved in the isolation of these bacteria, which provides an interesting opportunity for carrying out both genomic as metagenomic studies. This work aimed to investigate the genomic and functional characteristics of the strain Nostoc sp. CENA67, isolated from anthropogenic dark earth, and to study its associated community. For this purpose, cells from a non-axenic culture of Nostoc sp. CENA67 were sequenced with the platforms MiSeq and Ion PGM and analyzed with genomic and metagenomic tools. The strain CENA67 indeed belongs to the family Nostocaceae and presents some characteristics in common with cyanobacteria of the genus Nostoc, but diverges in certain morphological and phylogenetic aspects of the typical Nostoc group, suggesting that it is a representative of a new taxon. In addition, its genome presents differences in relation to the genomes currently available for cyanobacteria related to this genus. Genome mining revealed 31 gene clusters hypothetically related to the synthesis of secondary metabolites, most of which did not show significant similarity to known clusters. The analysis of a microviridin gene cluster unveiled a larger diversity of precursor genes for this molecule than was previously believed, suggesting that a considerable number of variants is still to be found. The taxonomic analysis of the associated community confirmed the dominance of cyanobacteria in the culture, but also revealed the presence of a great number of microbial genera that are usually capable of fixing atmospheric nitrogen and establishing symbiosis with plants, including Mesorhizobium, Sinorhizobium, and Starkeya, among others. Genomic drafts were obtained for Bradyrhizobium diazoefficiens, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia lata, and Hyphomicrobium nitrativorans. Nevertheless, genes for nitrogen fixation were not detected in these genomes, despite being found in the cyanobacterial genome and the community metagenome, suggesting that some populations might be under selection pressure for the loss of the ability to fix nitrogen, probably due to this nutrient being provided for the most abundant organism in this culture, the cyanobacterium. Functional analysis indicated pathways exclusive both to the cyanobacterium as to the associated community, and suggested the complementarity of certain metabolisms. The results allow the increase of the knowledge about the molecular and chemical diversity of the phylum Cyanobacteria and raise possible interactions with symbiotic microorganisms