O ácido copálico é um diterpeno de esqueleto do tipo labdano descrito na literatura como um dos diterpenos majoritários e biomarcador do oleorresina das espécies do gênero Copaifera. Este oleorresina é muito utilizado na medicina popular e estudos feitos com oleorresinas de diferentes espécies revelaram várias atividades biológicas. Entretanto, não há informações sobre o metabolismo dos constituintes do oleorresina após absorção no organismo. Assim, neste trabalho foram realizados estudos de biotransformação do ácido copálico com micro-organismos que apresentam potencial para mimetizar reações que ocorrem em humanos e também com alguns microorganismos presentes no trato gastrointestinal humano. O ácido copálico foi obtido de oleorresina de Copaifera disponível no mercado nacional. Devido à complexidade química do oleorresina, houve necessidade de utilizar vários processos cromatográficos visando o isolamento do ácido copálico. Assim, foram utilizadas cromatografia sob pressão reduzida, cromatografia em coluna clássica e cromatografia em coluna clássica utilizando sílica impregnada com nitrato de prata. Partindo-se de 352,0 g de oleorresina foram isolados 1224,5 mg de ácido copálico, o qual foi identificado pelas análises dos espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e de carbono treze. O diterpeno isolado foi submetido à avaliação da atividade antimicrobiana frente aos microorganismos a serem avaliados nos processos de biotransformação, o que possibilitou estabelecer a quantidade máxima de ácido copálico a ser adicionada nas culturas dos diferentes micro-organismos sem causar interferência no desenvolvimento dos mesmos. Os fungos filamentosos Mucor rouxii e Aspergillus brasiliensis, bem como as bactérias do trato gastrointestinal Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus e Escherichia coli foram utilizados no processo de triagem visando selecionar o micro-organismo mais promissor para os estudos de biotransformação do ácido copálico. Também foram realizados estudos em cultura mista de Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus e Streptococcus salivarius subesp.thermophilus. O processo de biotransformação conduzido com o fungo filamentoso Mucor rouxii evidenciou o potencial deste para biotransformar o ácido copálico. Os extratos obtidos das culturas do fungo Mucor rouxii foram submetidos às análises por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por aerossol carregado e por arranjo de diodos, sendo detectados seis produtos de biotransformação que foram isolados por cromatografia líquida de alta eficiência em escala semi-preparativa. No processo de biotransformação realizado com o fungo filamentoso Aspergillus brasiliensis vários produtos foram detectados, mas com baixos rendimentos. Quanto aos estudos de biotransformação realizados com as bactérias, não foram detectados sinais de diterpenos nas culturas de Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium sp. isoladas e em cultura mista incubadas com ácido copálico por 24 horas. Nas culturas de Escherichia coli foram detectados sinais do ácido copálico, mas não de produtos de biotransformação. Seis produtos de biotransformação foram isolados da cultura desenvolvida com o fungo Mucor rouxii. Dois destes tiveram suas estruturas químicas elucidadas. Nos dois produtos ocorreram hidroxilações no C-3 e no C-13 e em um dos produtos ocorreu também hidroxilação no C-18. Não há descrição na literatura das estruturas químicas dos produtos elucidados. / Copalic acid is a labdane type diterpene which was reported in the literature as a major constituent and biomarker of the oil resin from Copaifera species. This oil resin has been used in popular medicine and studies carried out with different species showed several biological activities. However, there is no information regarding the metabolism of the constituents after absorption in organism. Therefore, biotransformation studies were carried out using microorganisms that showed potential to mimic reactions that occur in human and also with microorganisms from the gastrointestinal tract. Copalic acid was obtained from Copaifera oil resin available in national market. Due to the chemical complexity, it was necessary to perform different chromatographic procedures in order to isolate copalic acid. Column chromatography, column chromatography under reduced pressure and column chromatography using silica gel impregnated with silver nitrate were performed. Starting from 352.0 g of oil resin, 1224.5 mg of copalic acid were isolated and the chemical structure was determined by analysis of the hydrogen and carbon nuclear magnetic ressonance. The isolated diterpene was submitted to antimicrobial activity evaluation against the microorganisms used in the biotransformation processes which enable to establish the maximum amount of copalic acid to be added into the cultures without causing inhibitory effects. The filamentous fungi Mucor rouxii and Aspergillus brasiliensis, as well as the bacteria Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus and Escherichia coli from the gastrointestinal tract were screened to select the most promising microorganism for biotransformation studies. In addition, biotransformation processes were carried out using mixed cultures of Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus and Streptococcus salivarius subesp.thermophilus. The biotransformation process performed by the filamentous fungis Mucor rouxii showed the great potential of this fungus to biotransform copalic acid. The extracts from the cultures of the fungus Mucor rouxii were submitted to high performance liquid chromatography with both charged aerosol and photodiode array detection and six biotransformation products were isolated by using high performance liquid chromatography in semi-preparative mode. Several biotransformation products were detected in the biotransformation process performed by Aspergillus brasiliensis, but with low yield. Regarding the biotransformation processes performed by bacteria, biotransformation products were not detected in the isolated and mixed cultures of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium sp. after 24 hours. Also, only the signals of copalic acid were detected in the cultures of Escherichia coli. Six biotransformation products were isolated from the culture of the fungus Mucor rouxii. The chemical structures of two products were elucidated. Hydroxyl groups were introduced at C-3 and C-13 in both compounds and another hydroxyl group was introduced at C-18 in only one compound. These structures were not reported before.

O ácido copálico é um diterpeno de esqueleto do tipo labdano descrito na literatura como um dos diterpenos majoritários e biomarcador do oleorresina das espécies do gênero Copaifera. Este oleorresina é muito utilizado na medicina popular e estudos feitos com oleorresinas de diferentes espécies revelaram várias atividades biológicas. Entretanto, não há informações sobre o metabolismo dos constituintes do oleorresina após absorção no organismo. Assim, neste trabalho foram realizados estudos de biotransformação do ácido copálico com micro-organismos que apresentam potencial para mimetizar reações que ocorrem em humanos e também com alguns microorganismos presentes no trato gastrointestinal humano. O ácido copálico foi obtido de oleorresina de Copaifera disponível no mercado nacional. Devido à complexidade química do oleorresina, houve necessidade de utilizar vários processos cromatográficos visando o isolamento do ácido copálico. Assim, foram utilizadas cromatografia sob pressão reduzida, cromatografia em coluna clássica e cromatografia em coluna clássica utilizando sílica impregnada com nitrato de prata. Partindo-se de 352,0 g de oleorresina foram isolados 1224,5 mg de ácido copálico, o qual foi identificado pelas análises dos espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e de carbono treze. O diterpeno isolado foi submetido à avaliação da atividade antimicrobiana frente aos microorganismos a serem avaliados nos processos de biotransformação, o que possibilitou estabelecer a quantidade máxima de ácido copálico a ser adicionada nas culturas dos diferentes micro-organismos sem causar interferência no desenvolvimento dos mesmos. Os fungos filamentosos Mucor rouxii e Aspergillus brasiliensis, bem como as bactérias do trato gastrointestinal Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus e Escherichia coli foram utilizados no processo de triagem visando selecionar o micro-organismo mais promissor para os estudos de biotransformação do ácido copálico. Também foram realizados estudos em cultura mista de Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus e Streptococcus salivarius subesp.thermophilus. O processo de biotransformação conduzido com o fungo filamentoso Mucor rouxii evidenciou o potencial deste para biotransformar o ácido copálico. Os extratos obtidos das culturas do fungo Mucor rouxii foram submetidos às análises por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por aerossol carregado e por arranjo de diodos, sendo detectados seis produtos de biotransformação que foram isolados por cromatografia líquida de alta eficiência em escala semi-preparativa. No processo de biotransformação realizado com o fungo filamentoso Aspergillus brasiliensis vários produtos foram detectados, mas com baixos rendimentos. Quanto aos estudos de biotransformação realizados com as bactérias, não foram detectados sinais de diterpenos nas culturas de Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium sp. isoladas e em cultura mista incubadas com ácido copálico por 24 horas. Nas culturas de Escherichia coli foram detectados sinais do ácido copálico, mas não de produtos de biotransformação. Seis produtos de biotransformação foram isolados da cultura desenvolvida com o fungo Mucor rouxii. Dois destes tiveram suas estruturas químicas elucidadas. Nos dois produtos ocorreram hidroxilações no C-3 e no C-13 e em um dos produtos ocorreu também hidroxilação no C-18. Não há descrição na literatura das estruturas químicas dos produtos elucidados. / Copalic acid is a labdane type diterpene which was reported in the literature as a major constituent and biomarker of the oil resin from Copaifera species. This oil resin has been used in popular medicine and studies carried out with different species showed several biological activities. However, there is no information regarding the metabolism of the constituents after absorption in organism. Therefore, biotransformation studies were carried out using microorganisms that showed potential to mimic reactions that occur in human and also with microorganisms from the gastrointestinal tract. Copalic acid was obtained from Copaifera oil resin available in national market. Due to the chemical complexity, it was necessary to perform different chromatographic procedures in order to isolate copalic acid. Column chromatography, column chromatography under reduced pressure and column chromatography using silica gel impregnated with silver nitrate were performed. Starting from 352.0 g of oil resin, 1224.5 mg of copalic acid were isolated and the chemical structure was determined by analysis of the hydrogen and carbon nuclear magnetic ressonance. The isolated diterpene was submitted to antimicrobial activity evaluation against the microorganisms used in the biotransformation processes which enable to establish the maximum amount of copalic acid to be added into the cultures without causing inhibitory effects. The filamentous fungi Mucor rouxii and Aspergillus brasiliensis, as well as the bacteria Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus and Escherichia coli from the gastrointestinal tract were screened to select the most promising microorganism for biotransformation studies. In addition, biotransformation processes were carried out using mixed cultures of Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus and Streptococcus salivarius subesp.thermophilus. The biotransformation process performed by the filamentous fungis Mucor rouxii showed the great potential of this fungus to biotransform copalic acid. The extracts from the cultures of the fungus Mucor rouxii were submitted to high performance liquid chromatography with both charged aerosol and photodiode array detection and six biotransformation products were isolated by using high performance liquid chromatography in semi-preparative mode. Several biotransformation products were detected in the biotransformation process performed by Aspergillus brasiliensis, but with low yield. Regarding the biotransformation processes performed by bacteria, biotransformation products were not detected in the isolated and mixed cultures of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium sp. after 24 hours. Also, only the signals of copalic acid were detected in the cultures of Escherichia coli. Six biotransformation products were isolated from the culture of the fungus Mucor rouxii. The chemical structures of two products were elucidated. Hydroxyl groups were introduced at C-3 and C-13 in both compounds and another hydroxyl group was introduced at C-18 in only one compound. These structures were not reported before.

Oleorresinas de espécies de Copaifera sp são amplamente utilizadas na medicina popular brasileira e estudos químicos e biológicos demonstram que diterpenos e sesquiterpenos estão entre os principais compostos bioativos das oleorresinas. Um importante fator para a avaliação da segurança e eficácia de fármacos é o conhecimento sobre o seu metabolismo, o qual pode ser adquirido por meio de estudos de biotransformação utilizando fungos filamentosos e bactérias do trato gastrointestinal. Os fungos filamentosos são organismos eucariotos e o aparato enzimático se assemelha com o dos mamíferos podendo contribuir para a elucidação de rotas metabólicas fornecendo informações sobre a formação de produtos farmacologicamente ativos, inativos ou tóxicos para o organismo. Esses estudos podem ainda contribuir para a obtenção de substâncias inéditas com potencial atividade biológica. O uso de bactérias da microbiota intestinal em estudos de metabolismo também é importante, pois os medicamentos e alimentos, quando ingeridos, podem ser metabolizados por essas bactérias que colonizam o trato gastrointestinal. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de fungos filamentosos e de bactérias do trato gastrointestinal para biotransformar o ácido 3?-acetoxi-copálico e ?-cariofileno, presentes em oleorresinas de Copaifera, bem como isolar os produtos de biotransformação para avaliação da citotoxidade. Os experimentos de biotransformação foram realizados com 10 linhagens de fungos filamentosos e com 8 linhagens de bactérias do trato gastrointestinal. Os extratos obtidos em acetato de etila das culturas das biotransformações do diterpeno foram analisados por CLAE/DAD/CAD e CLAE-EM e os extratos obtidos em n-hexano e em acetato de etila das culturas das biotransformações do sesquiterpeno, bem como a fração volátil captada das culturas por microextração em fase sólida (SPME) no modo headspace, foram analisados por CG-EM. Todos os micro-organismos testados foram capazes de biotransformar o ácido 3?-acetoxi-copálico e 9 produtos de biotransformação foram isolados, suas estruturas químicas foram identificadas, sendo seis inéditos e todos os produtos foram avaliados quanto a atividade citotóxica frente às linhagens celulares de glândulas mamárias normais (MCF-10A) e de adenocarcinoma mamário (MCF-7). Todos os metabólitos do ácido 3?-acetoxi-copálico apresentaram menor citotoxidade frente as linhagens avaliadas do que o próprio ácido 3?-acetóxi-copálico. Os fungos A. niger, A. brasiliensis e as três linhagens de Cunninghamella foram capazes de biotransformar o ?-cariofileno. Entretanto, como não foram obtidos bons rendimentos nesses processos, não foi possível isolar os produtos de biotransformação. Com os dados obtidos foi possível apenas elaborar uma proposta para a estrutura química de um dos produtos oriundos da biotransformação do ?-cariofileno realizada com C. echinulata ATCC 9245. / Oleoresins from Copaifera sp species are widely used in Brazilian folk medicine and chemical and biological studies showed that diterpenes and sesquiterpenes are among the main bioactive compounds of oleoresins. An important factor for assessing the safety and efficacy of drugs is the knowledge about their metabolism, which can be acquired through biotransformation studies using filamentous fungi and human gut bacteria. Filamentous fungi are eukaryotic organisms and the enzymatic apparatus is similar to those of mammals and may contribute to the elucidation of metabolic pathways providing information on the production of pharmacologically active, inactive or toxic compounds to the organism. These studies may also contribute to provide new compounds with potential biological activity. The use of human gut bacteria in metabolism studies is also important because drugs and foods, when ingested, can be metabolized by bacteria that colonize the gastrointestinal tract. The aim of this study was to evaluate the potential of filamentous fungi and human gut bacteria to biotransform 3?-acetoxy-copalic acid and ?-caryophyllene found in oleoresins from Copaifera as well as to isolate the biotransformation products for evaluation of their cytotoxicity. Biotransformation experiments were carried out with 10 filamentous fungi strains and 8 human gut bacteria strains. The ethyl acetate extracts obtained from the biotransformation processes of diterpene were analyzed by HPLC/DAD/CAD and HPLC-MS and n-hexane and ethyl acetate extracts obtained from the biotransformation processes of sesquiterpene, as well as the volatile fraction collected by solid phase microextraction headspace, were analyzed by GC-MS. All tested microorganisms were able to biotransform the 3?-acetoxy-copalic acid and 9 biotransformation products were isolated, their chemical structures were identified, from which six are new and all the products were evaluated for cytotoxic activity against normal mammary gland (MCF-10A) and breast adenocarcinoma (MCF-7) cell lines. All metabolites of 3?-acetoxy-copalic acid showed lower cytotoxicity against the evaluated cell lines than the 3?-acetoxy-copalic acid. The fungi A. niger, A. brasiliensis and the three Cunninghamella strains were able to biotransform ?-caryophyllene. However, as good yields were not achieved in these processes, it was not possible to isolate the biotransformation products. The obtained data became possible to just make a proposal for the chemical structure of a product from the ?-caryophyllene biotransformation process performed by C. echinulata ATCC 9245.