Οι μέχρι τώρα ενδείξεις από τη βιβλιογραφία εισηγούνται ένα πιθανό προστατευτικό ρόλο των οιστρογόνων στην καρκινογένεση στο παχύ έντερο. Η έκφραση των οιστρογονικών υποδοχέων στο φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου, στα αδενώματα και τα καρκινώματα και οι αλληλεπιδράσεις τους με διάφορους συμπαράγοντες θα πρέπει να μελετηθούν υπό το πρίσμα των πολύπλοκων μοριακών δικτύων μεταξύ επιθηλιακών κυττάρων και μυοϊνοβλαστών του στρώματος, αλλά και της θεωρίας των βλαστικών κυττάρων που φαίνεται να ενέχονται στην καρκινογένεση. Η έκφραση των ERα, ERβ1, ΑΙΒ-1, TIF-2, PELP1, NCoR και ALDH1 μελετήθηκε ανοσοϊστοχημικά σε 107 καρκινώματα παχέος εντέρου, σε 77 δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου και σε 29 αδενώματα του ίδιου οργάνου. Εκτιμήθηκαν τόσο τα επιθηλιακά κύτταρα όσο και οι μυοϊνοβλάστες. Για την ακριβέστερη εκτίμηση των μυοϊνοβλαστών, συνεχόμενες ιστολογικές τομές υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημικό έλεγχο με χρήση των anti-αSMA και CD34 αντισωμάτων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση των ERβ1, ΑΙΒ-1, ΤΙF-2 και PELP1 ήταν πιο συχνή σε μυοϊνοβλάστες του στρώματος των καρκινωμάτων σε σχέση με τα αδενώματα και το φυσιολογικό βλεννογόνο. Επίσης, στους μυοϊνοβλάστες των καρκινωμάτων, ο NCoR εντοπιζόταν αποκλειστικά στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων. Αντίθετα, δεν υπήρχε διαφορά στο ποσοστό έκφρασης των δεικτών αυτών στα επιθηλιακά κύτταρα μεταξύ του φυσιολογικού βλεννογόνου, των αδενωμάτων και των καρκινωμάτων. Ωστόσο, η κυτταροπλασματική εντόπιση του ERβ1 ήταν συχνότερη στα επιθηλιακά κύτταρα των καρκινωμάτων σε σχέση με το φυσιολογικό βλεννογόνο και τα αδενώματα. Επίσης, ο NCoR εκφραζόταν πιο συχνά στο κυτταρόπλασμα και σπανιότερα στον πυρήνα των κακοήθων επιθηλιακών κυττάρων σε σχέση με τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα. Η κυτταροπλασματική έκφραση του NCoR στα επιθηλιακά κύτταρα σχετιζόταν με μεγαλύτερη ελεύθερη νόσου και συνολική επιβίωση και αποτελούσε ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη της ελεύθερης νόσου επιβίωσης. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ένα πιθανό ρόλο της ενεργοποίησης του μονοπατιού των οιστρογονικών υποδοχέων στους μυοϊνοβλάστες του στρώματος, στην ανάπτυξη των καρκινωμάτων του παχέος εντέρου. Επίσης, η κυτταροπλασματική μετατόπιση, από τον πυρήνα, του NCoR στα επιθηλιακά κύτταρα, πιθανότατα επηρεάζει διάφορα μοριακά δίκτυα στον πυρήνα των κυττάρων, επιφέροντας ταυτόχρονα ογκοπροαγωγές δράσεις στα επιθηλιακά κύτταρα του βλεννογόνου και ογκοκατασταλτικές επιδράσεις στα αναπτυσσόμενα νεοπλάσματα. Δεδομένου ότι, η πυρηνική έκφραση του NCoR έχει προταθεί ως δείκτης των stem κυττάρων, τα ελάχιστα κύτταρα, στα οποία παρατηρήθηκε πυρηνική έκφραση στον καρκίνο παχέος εντέρου, πιθανότατα, αντιστοιχούν σε καρκινικά stem κύτταρα. Η ALDH1 αποτελεί, επίσης, δείκτη φυσιολογικών και καρκινικών stem κυττάρων σε διάφορα όργανα. Στη μελέτη μας η ALDH1 εκφράστηκε έντονα σε κύτταρα του φυσιολογικού βλεννογόνου, τα οποία βρίσκονταν στη βάση των κρυπτών και πιθανότατα αντιπροσωπεύουν τα stem/προγονικά κύτταρα του εντερικού επιθηλίου. Κατά αντιστοιχία, η έκφραση της ALDH1 στα καρκινικά κύτταρα σχετιζόταν με παρουσία μεταστάσεων και χειρότερη ελεύθερη νόσου επιβίωση. Το εύρημα αυτό, πιθανόν, να αποτελεί ένα δείκτη των καρκινικών stem/προγονικών κυττάρων. Αντίθετα, η έκφραση ALDH1 στους μυοϊνοβλάστες των καρκινωμάτων σχετιζόταν με ευνοϊκούς προγνωστικούς παράγοντες και μεγαλύτερο ελεύθερο νόσου διάστημα. Επίσης, περιστατικά με χαμηλή έκφραση ALDH1 στους μυοϊνοβλάστες και υψηλή έκφραση στα επιθηλιακά κύτταρα σχετιζόταν με μικρότερο διάστημα ελεύθερη νόσου επιβίωσης, αλλά και συνολικής επιβίωσης. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν το σημαντικό ρόλο των πολύπλοκων αλληλεπιδράσεων επιθηλίου-στρώματος κατά την καρκινογένεση στο παχύ έντερο και επισημαίνουν τα πολύπλοκα μοριακά δίκτυα που ρυθμίζουν τη λειτουργία των κυττάρων. Η συστημική προσέγγιση των επιθηλιακών κυττάρων και της παθολογίας τους προϋποθέτει τη μελέτη των μορίων τους μέσα σε πολύπλοκα δίκτυα που επηρεάζουν τη δράση τους με μη γραμμικό τρόπο και περιλαμβάνει αμφίδρομες αλληλεπιδράσεις από τα περιβάλλοντα κύτταρα. / Background. The stochastic model of carcinogenesis is recently challenged by the stem cell model. The later suggests that cancer develops from uncontrolled proliferation and aberrant differentiation of adult stem cells or progenitor cells that acquire stem cell-like properties. Microenvironment regulates function and differentiation of normal epithelial cells creating a protective niche for stem cells. Additionally, microenvironment plays a critical role in induction and progression of carcinomas. Both mutations in adult stem cells and changes in signals emanating from the stem cell niche contribute to the initiation of carcinomas. Recent findings suggest a protective role of estrogens in colorectal carcinogenesis. However, estrogens exert various actions on cells depending on the molecular microenvironment and their cross-talk with intracellular cascades and coregulators of transcription. Additionally, estrogens modulate the function of stromal cells and might influence carcinogenesis by indirect actions. Elucidation of the molecular networks implicated in estrogen signaling is very important in view of the potential use of selective estrogen receptor modulators in chemoprevention and targeted anticancer therapy. Materials and methods. An immunohistochemical study was designed to analyze the estrogen receptors α and β and the various co-regulators of transcription expression of along with that of a proposed functional stem cell marker, ALDH1, in normal colonic mucosa, adenomas and colorectal carcinomas. One hundred seven cases of colorectal carcinoma were retrieved from the Pathology files of the University Hospital of Patras, Greece. None of the patients had received preoperative chemotherapy or radiotherapy. All female patients were at the postmenopausal age. Follow-up was available for all patients. Paired normal mucosa and adenoma specimens were evaluated in 77 and 29 cases, respectively, in an effort to examine the whole spectrum of the multistage progression of colorectal carcinogenesis. Primary antibodies against ERα, ERβ1, AIB-1, TIF-2, PELP1, NCoR and ALDH1 and the Envision polymer-based detection system were employed. Epithelial cells and stromal myofibroblasts were separately assessed. α-SMA and CD34 staining of serial histologic sections was valuable for the recognition of the myofibroblastic nature of the cells. Results. ERα expression was extremely rare and was noted in <1% of the epithelial cells in two cases of colorectal carcinoma. ERβ1, TIF-2, and NCoR were expressed in the nuclei and cytoplasm of epithelial cells and myofibroblasts. AIB-1 and PELP-1 were expressed in the nuclei of epithelial cells and myofibroblasts. PELP-1 displayed a dot-like pattern of staining in the nuclei of cells that is possibly attributed to the presence of focally increased concentration of PELP1 in multiprotein co-regulator complexes within the nuclei of cells. Statistical analysis revealed that nuclear and cytoplasmic expression of ERβ1 and TIF-2 and nuclear expression of AIB-1 and PELP1 in myofibroblasts increased from normal mucosa through adenoma to carcinomas. NCoR was expressed in the cytoplasm of carcinoma-associated fibroblasts but not in myofibroblasts of normal mucosa. Thus, various components of estrogen signaling namely ERβ1 (both genomic and non-genomic actions-associated localization) and co-regulators of transcription, are enhanced in cancer associated myofibroblasts, whereas co-repressor NCoR is expressed in the cytoplasm of the cells implying that ER signaling is enhanced in myofibroblasts of carcinomas. In contrast, nuclear expression of ERβ1, AIB-1, TIF-2, and PELP-1 in epithelial cells was not different among normal mucosa, adenomas and carcinomas. Cytoplasmic expression of ERβ1 was higher in colorectal carcinomas, implying activation of non-genomic actions of ERβ in colorectal carcinogenesis. A translocation of NCoR from the nucleus to the cytoplasm was noted in colorectal carcinomas, since nuclear expression was more common in normal mucosa and cytoplasmic expression was noted in the majority of carcinomas. Cytoplasmic expression of NCoR in epithelial cells was associated with favorable prognosis. These findings might suggest that derepression of NCoR repressed transcription is an important feature of colorectal carcinogenesis and correlates with patients’ prognosis. ALDH1 expression was noted in the nuclei and the cytoplasm of myofibroblasts and epithelial cells. Expression in myofibroblasts was more often noted in carcinomas compared to normal mucosa and was associated with absence of metastasis and favorable prognosis. Epithelial cells of normal mucosa expressed high levels of ALDH1 expression. A distinct pattern of ALDH1 expression along the crypt axis was noted. Nuclear expression was more common and cytoplasmic expression was intensified at the base of the crypts (compartment where epithelial stem cells reside) compared to superficial epithelium. Carcinomas displayed heterogenous expression of ALDH1 in epithelial cells. Increased cytoplasmic expression was associated with the presence of metastasis and poor prognosis. Thus, ALDH1 expression had distinct impacts on metastatic potential of carcinomas and patients’ prognosis, accordingly to the cell where it is expressed. Additionally, patients with increased expression in epithelial cells and decreased expression in myofibroblasts had worse prognosis compared to patients displaying all other combinations of ALDH1 expression in epithelial cells and myofibroblasts. Our findings imply a possible role of ALDH1 as a stem/progenitor cell marker in normal mucosa. The association of ALDH1 expression in malignant cells with metastatic potential and worse prognosis implies that it might represent a marker of carcinomas with increased stem/progenitor cell content. The favorable prognostic role of ALDH1 expression in myofibroblasts might be associated with its role in local retinoic acid production. Retinoic acid has various tumor suppressive roles in colorectal carcinomas and can potentially be used in chemopreventive or chemotherapeutic strategies especially in patients with low local production levels. Thus, a comprehensive analysis of molecular networks both in any single cell and among the different cells of colorectal carcinomas and non neoplastic mucosa are mandatory in order to elucidate the role of estrogen signaling in colorectal carcinogenesis in view of development of targeted clinical applications. Conclusions 1.ERβ is the predominant estrogen receptor in colonic tissue. 2.ERβ1 dependent signaling is enhanced in cancer-associated myofibroblasts. 3.PELP1 is associated with genomic actions in both epithelial cells and myofibroblats. 4.In epithelial cells, loss of NCoR nuclear expression correlates with colorectal carcinogenesis possibly through derepression of transcription mediated by various transcription factors. 5.ALDH1 emerges as a marker of normal and cancer stem cells of colorectal carcinomas.

Τα αστροκυττώματα αποτελούν το συχνότερο τύπο πρωτοπαθών όγκων του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) και παραδοσιακά θεωρούνται ότι σχετίζονται με ιδιαίτερα δυσμενή πρόγνωση. Η Συστημική προσέγγιση της καρκινογένεσης, εστιάζοντας στην αποκρυπτογράφηση του τρόπου λειτουργίας και δυναμικής αλληλεπίδρασης πολύπλοκων παθοβιολογικών δικτύων, προσφέρει σήμερα καινούριες ερευνητικές προοπτικές και πιθανές εναλλακτικές, περισσότερο αποτελεσματικές θεραπευτικές στρατηγικές. Οι οιστρογονικοί υποδοχείς και οι συν – ρυθμιστές της μεταγραφής συνιστούν κομβικά σημεία “συνομιλίας” (cross – talk) πολύπλοκων μοριακών οδών του κυττάρου, διαμεσολαβώντας πλήθος κυτταρικών λειτουργιών φυσιολογικά αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις, ανάμεσα στις οποίες και ο καρκίνος. Οι παράγοντες EZH2 και SOX2 θεωρούνται μόρια κλειδιά του ρυθμιστικού μεταγραφικού κυκλώματος που χαρακτηρίζει το stemness. Η αποσαφήνιση της συμπεριφοράς του συγκεκριμένου αυτού δικτύου στα διάφορα νεοπλάσματα και ρόλος του σε σχέση με την απόκτηση ιδιότητας καρκινικού stem κυττάρου, θεωρείται καθοριστικής σημασίας στην προσπάθεια ερμηνείας του φαινομένου του καρκίνου ως πολύπλοκο προσαρμόσιμο σύστημα, που θα αναδείξει εναλλακτικούς θεραπευτικούς στόχους και θα επιτρέψει περισσότερο αποτελεσματικές σε σχέση με τις υπάρχουσες παρεμβάσεις. Σκοπός. Υπό το πρίσμα της Συστημικής προσέγγισης της κατανόησης της κακοήθους ανάπτυξης και εξέλιξης των αστροκυτταρικών όγκων, η παρούσα μελέτη διερεύνησε τα επίπεδα έκφρασης του Οιστρογονικού υποδοχέα β (ERβ), και των συν – ρυθμιστών AIB1, TIF2 and PELP1, όπως και την έκφραση των παραγόντων EZH2 και SOX2 σε αστροκυττώματα grade II ως IV και τη συσχέτιση μεταξύ του προφίλ έκφρασης των συγκεκριμένων παραγόντων, με κλινικοπαθολογικά δεδομένα. Υλικό και μέθοδος. Η έκφραση των πρωτεϊνών ERβ, AIB1, TIF2, PELP1, EZH2 και SOX2 εκτιμήθηκε σε 86 περιπτώσεις αστροκυτταρικών όγκων χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Είκοσι grade II αστροκυττώματα, 22 grade III αναπλαστικά αστροκυττώματα και 46 grade IV πλειόμορφα γλοιοβλαστώματα (GBM) συμπεριλήφθησαν στη συγκεκριμένη μελέτη. Η μέθοδος με χρήση συστήματος ανίχνευσης EnVision (Envision, Dako, CA, USA) ή MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, CA, USA) και πρωτογενή αντισώματα έναντι των ERβ (Biogenex, CA, USA), AIB1 (BD Biosciences, Ca, USA), TIF2 (BD Biosciences, Ca, USA), PELP-1/MNAR (Novus Biologicals, CO, USA) EZH2 (Novocastra, UK) και SOX2 (R&D Systems, Inc.) χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Σε κάθε περιστατικό και για κάθε δείκτη εκτιμήθηκε το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων που εμφάνιζαν θετική ανοσοχρώση. Αντιπροσωπευτικές περιοχές επιλέχθηκαν κατόπιν σάρωσης του πλακιδίου σε οπτικό πεδίο μικρής μεγέθυνσης (Χ100), ενώ η καταμέτρηση των θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε μεγάλης μεγέθυνσης πεδίο (400X). Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS στατιστικού πακέτου (SPSS©, Release 17.0, Chicago, IL, USA). Τιμές p<0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Αποτελέσματα. Σημαντική μείωση των επιπέδων του ERβ παρατηρήθηκε παράλληλα με την αύξηση του grade. Επιπλέον, η υψηλή ERβ έκφραση αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος θετικός προγνωστικός παράγοντας της συνολικής επιβίωσης κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση. Η έκφραση των AIB1, TIF2 και PELP1, δε συσχετίσθηκε με αυτή του ERβ, και ακολούθησε αντιστρόφως ανοδική τάση, παράλληλα με την αύξηση του grade. Η στατιστική ανάλυση περαιτέρω, ανέδειξε μία σημαντική αύξηση τόσο των επιπέδων EZH2 όσο και SOX2 στα grade III και IV σε σχέση με τα grade II αστροκυττώματα. Ισχυρή συσχέτιση παρατηρήθηκε ως προς την έκφραση των δύο δεικτών σε όλες τις κατά grade υποομάδες. Η Kaplan-Meier ανάλυση έδειξε ότι, η υψηλή EZH2 και SOX2 πρωτεϊνική έκφραση συνιστούν αρνητικό παράγοντα πρόγνωσης τόσο στο σύνολο των ασθενών όσο και κατόπιν διαστρωμάτωσης κατά grade. Τέλος, η πολυπαραγοντική Cox ανάλυση συνυπολογίζοντας την ηλικία, το φύλο, το grade και την έκφραση των δύο πρωτεϊνών έδειξε ότι μόνο η υψηλή EZH2 έκφραση μαζί με το υψηλό grade, αποτελούν ανεξάρτητους παράγοντες δυσμενούς πρόγνωσης. Συμπεράσματα. Οι παράγοντες ERβ, AIB1, TIF2 και PELP1 ενέχονται στους παθογενετικούς μηχανισμούς ανάπτυξης και εξέλιξης των αστροκυτταρικών όγκων, με τον ERβ να διαδραματίζει προστατευτικό ρόλο και τους AIB1, TIF2 και PELP1 να εμφανίζουν ογκο – προαγωγό δράση. Το ογκογενετικό δυναμικό των παραγόντων AIB1, TIF2 και PELP1 φαίνεται πως διαμεσολαβείται μέσω ανεξάρτητων του οιστρογονικού υποδοχέα μηχανισμών. Η έκφραση του ERβ, διαχωρίζοντας κλινικές εκβάσεις σε ασθενείς ιδίου grade, θα μπορούσε να αποτελέσει ένα χρήσιμο εργαλείο κατά τη λήψη εξατομικευμένων κλινικών αποφάσεων. Οι παράγοντες EZH2 και SOX2, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως εν δυνάμει δείκτες καρκινικών stem κυττάρων σε αστροκυτταρικούς όγκους, να βοηθήσουν τη βελτιστοποίηση τόσο διαγνωστικών όσο και προγνωστικών διαδικασιών στην κλινική πράξη, και να κατευθύνουν την ανάπτυξη εξατομικευμένων στρατηγικών θεραπείας. / Astrocytic tumors are the most common primary neoplasms of the central nervous system (CNS) and have traditionally been associated with disappointing clinical outcomes. The current challenge is to develop more efficacious and targeted therapeutic paradigms, exploiting the knowledge derived from the systems approach of understanding the complex networks underlying tumor formation and progression. Estrogen receptor beta (ERβ) and co-regulators of transcription AIB1, TIF2 and PELP1, are key components of complex cellular networks and integrate diverse signaling afferents with transcription programs controlling various physiological cellular processes and a variety of disease states including cancer. SOX2 and EZH2 represent crucial components of the reciprocal regulatory circuit that controls stemness. Elucidating the behavior of this particular network in cancer and its role in the formation of putative cancer stem cells is considered essential for the understanding of cancer as an adaptive complex system and subsequently allowing the discovery of more successful therapeutic designs. Purpose. In the context of the systems approach of comprehending tumorigenesis in astrocytomas, we sought to investigate the expression of ERβ and co – regulatory proteins AIB1, TIF1 and PELP1, as well as parallel expression of SOX2 and EZH2 in astrocytomas of various grades, and correlate the protein expression profiles with clinicopathological parameters and patients’ prognosis. Materials and methods. Expression of ERβ, AIB1, TIF2, PELP1, EZH2 and SOX2 was evaluated in 86 cases of astrocytic tumors, using Immunohistochemistry, on formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Twenty grade II astrocytomas, 22 grade III anaplastic astrocytomas and 46 grade IV glioblastomas multiforme (GBM) were included in this study. Polymer based technique (Envision, Dako, CA, USA) or MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, CA, USA) and primary antibodies against ERβ1 (Biogenex, CA, USA), AIB1 (BD Biosciences, Ca, USA), TIF2 (BD Biosciences, Ca, USA), PELP-1/MNAR (Novus Biologicals, CO, USA) EZH2 (Novocastra, UK) and SOX2 (R&D Systems, Inc.) were used. In each case, the percentage of cells exhibiting positive staining was determined. Representative areas were selected at low power (x100) magnification. Cell counts were performed at a 400X magnification. Data were analyzed using the SPSS statistical package (SPSS©, Release 17.0, Chicago, IL, USA). The level of significance was set at p-value <0.05. Results. ERβ levels were significantly decreased with the progression of tumors’ grade. High expression of ERβ was an independent favorable prognostic factor on multivariate analysis. Expression of AIB1, TIF2 and PELP1, was not correlated to ERβ expression and followed an opposite trend, with increasing levels in grade III and IV relative to grade II tumors. Univariate survival analysis revealed that high AIB1, TIF2 and PELP1 expression was associated with worse prognosis. Statistical analysis further revealed significantly higher expression of EZH2 and SOX2 in high grade III and IV astrocytomas, compared to low grade II astrocytomas. Strong correlation between EZH2 and SOX2 was also detected within all subgroups according to grade. Kaplan-Meier showed that EZH2 and SOX2 high expression was predictive of worse overall survival in the whole cohort as well as after subgroup analysis by grade. Finally, multivariate Cox analysis that included age, gender, grade, and expression of both proteins, revealed that high EZH2 together with higher grade were strong negative prognostic factors. Conclusions. ERβ, AIB1, TIF2 and PELP1 appear to play an important role in the pathogenesis of astrocytic tumors, with ERβ exhibiting a protective effect, whereas AIB1, TIF2 and PELP1 facilitate malignant progression. AIB1, TIF2 και PELP1 contribution in tumor progression is speculated to be achieved through ERβ independent pathways. Moreover, the expression status of ERβ, by distinguish patient subpopulations with different prognosis within the same grade, could be a useful tool accommodating personalized clinical decision-making. EZH2 and SOX2 may serve as potential cancer stem cell markers in astrocytomas and as such help optimizing diagnostic and prognostic assessments and devising novel individually tailored treatment strategies.