Este estudo teve como objetivo pesquisar a ocorrência e diversidade molecular de coronavírus aviários em codornas e galinhas criadas nas mesmas propriedades e determinar o papel epidemiológico das codornas na bronquite infecciosa das galinhas (BIG). Para isso, foram coletados em granjas localizadas no estado de São Paulo e Espírito Santo pools de aparelho reprodutivo, pulmões, rins, traquéia e conteúdo entérico de codornas e galinhas com histórico de manifestações clínicas compatíveis com BIG. Estas amostras foram testadas para coronavírus aviário mediante uma semi-nested RT-PCR dirigida a região não-traduzida 3 (3´UTR) e as amostras positivas foram submetidas a RT-PCR do gene codificador da proteína RNA-polimerase RNA-dependente (RdRp) e duas RT-PCR, incluindo uma tipo multiplex dirigidas a proteína de espícula S do vírus da BIG, para genotipagem. Amplicons ou fragmentos amplificados da 3\'UTR (a partir de amostras de codorna) foram clonados e sequenciados. Outras duas RT-PCR foram utilizadas para detecção de metapneumovírus aviário (aMPV) e o vírus da doença de Newcastle (NDV). Coronavírus aviários foram encontrados em todos os tipos de amostras estudadas em galinhas e codornas criadas nas mesmas propriedades, sendo que aMPV subtipo B foi encontrado em galinhas e o NDV não foi encontrado em nenhuma amostras. Todos os coronavírus aviários encontrados, foram classificados como variantes pela multiplex RT-PCR, não sendo entretanto, obtidas sequências de DNA para o gene S. Com base em sequências de DNA para os genes codificadores da proteína RdRp e da região 3´UTR pode-se demonstrar que as codornas estudadas apresentaram o coronavírus aviário identificados como próximo àqueles relacionados à bronquite infecciosa das galinhas, havendo diversidade molecular filogeográfica para os vírus de codornas. Desta forma, sugere-se que as codornas podem servir como reservatórios para coronavírus aviários onde haja criações em proximidade com outras espécies aviárias. / This study aimed to investigate the occurrence and molecular diversity of avian coronavirus in quails and laying hens, raised on the same farms and determine the role of quails in the epidemiology of avian infectious bronchitis (IB). To this end, pools of lungs, trachea, female reproductive tracts, kidneys and enteric contents were collected from quails and laying hens flocks with IB-like symptoms, co-housed in farms located in Sao Paulo and Espírito Santo states, Brazil, during 2009-2010. Chickens and quails samples were screened for IBV with an RT-PCR to the 3UTR and positive samples were submitted to RT-PCRs to the RNA-dependent RNA-polymerase gene (RdRp) and two different RT-PCRs to the spike gene, including a typing-multiplex one. Amplicons of 3UTR (from quails samples) were cloned and sequenced. Two other RT-PCRs were used to detect the avian metapneumovirus (aMPV) and Newcastle disease virus (NDV). Avian coronavirus was found in all types of samples analyzed in chickens and quails raised on the same farms, aMPV subtype B was found in chickens and the NDV was not observed in any samples. All avian coronavirus found were classified as variants by multiplex RT-PCR, however, DNA sequences for gene S were not obtained. Based on the DNA sequences for genes encoding the protein RdRp and the 3\'UTR region can be show that avian coronavirus in quails are closely related to avian infectious bronchitis virus, with a molecular phylogeographic diversity for quails viruses; thus, quails might act as reservoirs for avian coronaviroses when in close contact with other avian species.

This study aimed to investigate the occurrence and molecular diversity of coronavirus in quail and laying hens raised on the same farms and quail only farms, to determine the role of quail as reservoir for avian infectious bronchitis virus (IBV). To this end, two investigations were carried out, one in the São Paulo state, Southeastern Brazil, in 2013, when some farmers started quail vaccination with Massachusetts IBV serotype after surveillance carried out in 2009-2010 and the other in two regions of Northern Italy, in 2015. In the Brazilian study, samples were collected as pools of tracheas, lungs, reproductive tract, kidneys and enteric contents from quail (Coturnix coturnix Japonica) and laying hens showing IB-like symptoms, while, in the Italian study, samples were collected as pools of tracheal and cloacal swabs and intestine/enteric content from European quail (Coturnix coturnix), showing enteric disorders. All samples were tested by a nested RT-PCR targeted to the 3\'UTR of the Gammacoronavirus genus. Positive samples were submitted to RT-PCR to the RNA-dependent RNA-polymerase gene (RdRp) and two different RT-PCRs to the spike gene, including a typing-multiplex one. Two other RT-PCRs were used to detect the avian metapneumovirus (aMPV) and Newcastle disease virus (NDV). Avian coronavirus was found in all types of samples analyzed in quail and chickens from both type of creations, aMPV subtype B was found in chickens (Brasil) and the NDV was not observed in any samples. Based on the DNA sequences for the RdRp gene, Brazilian and Italian quail strains clustered within either Gammacoronavirus or Deltacoronavirus genus, while, for one Brazilian sample, it was detected co-infection with the two genuses. Phylogeny based on partial S1 subunit sequences showed that the gammacoronaviruses detected in the Brazilian and Italian quail belong to the Brazil type and 793/B, respectively. These results suggest that quail are susceptible to Gamma and Deltacoronavirus and that quail avian coronavirus share spike genes identical to chicken infectious bronchitis virus (IBV); thus, quail might act as reservoirs for avian coronaviruses. Also, Massachusetts vaccination was not efficient to control IBV in Brazilian quail. / Este estudo teve como objetivo pesquisar a ocorrência e diversidade molecular de coronavírus em codornas e galinhas criadas nas mesmas propriedades e em codornas criadas em propriedades isoladas, para determinar o papel das codornas como reservatório para o vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV). Para isso, duas pesquisas foram realizadas, uma em 2013, no estado de São Paulo, Sudeste do Brasil, onde algumas granjas iniciaram a vacinação em codornas contra o IBV com o sorotipo Massachusetts, após um estudo realizado em 2009-2010; e a outra, em 2015, em duas regiões do Norte da Itália. No estudo brasileiro, foram coletados pools de aparelho reprodutor, pulmões, rins, traqueia e conteúdo entérico de codornas (Coturnix coturnix japonica() e galinhas com histórico de manifestações clínicas compatíveis com a Bronquite Infecciosa das galinhas (BIG). Por outro lado, no estudo italiano, as amostras foram coletadas em forma de pools de swabs traqueais e cloacais e intestino/conteúdo entérico de codornas (Coturnix coturnix) com sinais entéricos. Estas amostras foram testadas para os coronavírus aviário (Gammacoronavirus) mediante uma semi-nested RT-PCR dirigida a região não-traduzida 3 (3´UTR). As amostras positivas foram submetidas a RT-PCR do gene codificador da proteína RNA-polimerase RNA-dependente (RdRp) e duas RT-PCRs, incluindo uma multiplex dirigidas a proteína de espícula (S) do vírus da BIG, para genotipagem. Além disso, a detecção de metapneumovírus aviário (aMPV) e o vírus da doença de Newcastle (NDV) também foi realizada por meio de RT-PCRs. Coronavírus aviários foram encontrados em todos os tipos de amostras estudadas em codornas e galinhas de todos os tipos de criações, aMPV subtipo B foi encontrado em galinhas (Brasil) e o NDV não foi encontrado em nenhuma amostras. Com base nas sequências de DNA para o gene codificador da proteína RdRp, as amostras brasileiras e italianas foram agrupadas no gênero Gamma ou Deltacoronavirus, enquanto que, em uma amostra brasileira, foi detectada coinfecção pelos dois gêneros. A filogenia com base nas sequências parciais da subunidade S1da proteína de espícula, evidenciou que os Gammacoronavirus detectados nas codornas brasileiras e italianas pertencem ao genótipo Brasil e 793/B, respectivamente. Estes resultados sugerem que as codornas são suscetíveis aos coronavírus do gênero Gamma e Delta e os coronavírus aviários das codornas compartilham genes de espícula idênticos aos do IBV. Desta forma, sugere-se que as codornas podem servir como reservatórios para coronavírus aviários e que a vacinação com o sorotipo Massachusetts não foi eficiente no controle de IBV nas codornas brasileiras.

Este estudo teve como objetivo pesquisar a ocorrência e diversidade molecular de coronavírus aviários em codornas e galinhas criadas nas mesmas propriedades e determinar o papel epidemiológico das codornas na bronquite infecciosa das galinhas (BIG). Para isso, foram coletados em granjas localizadas no estado de São Paulo e Espírito Santo pools de aparelho reprodutivo, pulmões, rins, traquéia e conteúdo entérico de codornas e galinhas com histórico de manifestações clínicas compatíveis com BIG. Estas amostras foram testadas para coronavírus aviário mediante uma semi-nested RT-PCR dirigida a região não-traduzida 3 (3´UTR) e as amostras positivas foram submetidas a RT-PCR do gene codificador da proteína RNA-polimerase RNA-dependente (RdRp) e duas RT-PCR, incluindo uma tipo multiplex dirigidas a proteína de espícula S do vírus da BIG, para genotipagem. Amplicons ou fragmentos amplificados da 3\'UTR (a partir de amostras de codorna) foram clonados e sequenciados. Outras duas RT-PCR foram utilizadas para detecção de metapneumovírus aviário (aMPV) e o vírus da doença de Newcastle (NDV). Coronavírus aviários foram encontrados em todos os tipos de amostras estudadas em galinhas e codornas criadas nas mesmas propriedades, sendo que aMPV subtipo B foi encontrado em galinhas e o NDV não foi encontrado em nenhuma amostras. Todos os coronavírus aviários encontrados, foram classificados como variantes pela multiplex RT-PCR, não sendo entretanto, obtidas sequências de DNA para o gene S. Com base em sequências de DNA para os genes codificadores da proteína RdRp e da região 3´UTR pode-se demonstrar que as codornas estudadas apresentaram o coronavírus aviário identificados como próximo àqueles relacionados à bronquite infecciosa das galinhas, havendo diversidade molecular filogeográfica para os vírus de codornas. Desta forma, sugere-se que as codornas podem servir como reservatórios para coronavírus aviários onde haja criações em proximidade com outras espécies aviárias. / This study aimed to investigate the occurrence and molecular diversity of avian coronavirus in quails and laying hens, raised on the same farms and determine the role of quails in the epidemiology of avian infectious bronchitis (IB). To this end, pools of lungs, trachea, female reproductive tracts, kidneys and enteric contents were collected from quails and laying hens flocks with IB-like symptoms, co-housed in farms located in Sao Paulo and Espírito Santo states, Brazil, during 2009-2010. Chickens and quails samples were screened for IBV with an RT-PCR to the 3UTR and positive samples were submitted to RT-PCRs to the RNA-dependent RNA-polymerase gene (RdRp) and two different RT-PCRs to the spike gene, including a typing-multiplex one. Amplicons of 3UTR (from quails samples) were cloned and sequenced. Two other RT-PCRs were used to detect the avian metapneumovirus (aMPV) and Newcastle disease virus (NDV). Avian coronavirus was found in all types of samples analyzed in chickens and quails raised on the same farms, aMPV subtype B was found in chickens and the NDV was not observed in any samples. All avian coronavirus found were classified as variants by multiplex RT-PCR, however, DNA sequences for gene S were not obtained. Based on the DNA sequences for genes encoding the protein RdRp and the 3\'UTR region can be show that avian coronavirus in quails are closely related to avian infectious bronchitis virus, with a molecular phylogeographic diversity for quails viruses; thus, quails might act as reservoirs for avian coronaviroses when in close contact with other avian species.

This study aimed to investigate the occurrence and molecular diversity of coronavirus in quail and laying hens raised on the same farms and quail only farms, to determine the role of quail as reservoir for avian infectious bronchitis virus (IBV). To this end, two investigations were carried out, one in the São Paulo state, Southeastern Brazil, in 2013, when some farmers started quail vaccination with Massachusetts IBV serotype after surveillance carried out in 2009-2010 and the other in two regions of Northern Italy, in 2015. In the Brazilian study, samples were collected as pools of tracheas, lungs, reproductive tract, kidneys and enteric contents from quail (Coturnix coturnix Japonica) and laying hens showing IB-like symptoms, while, in the Italian study, samples were collected as pools of tracheal and cloacal swabs and intestine/enteric content from European quail (Coturnix coturnix), showing enteric disorders. All samples were tested by a nested RT-PCR targeted to the 3\'UTR of the Gammacoronavirus genus. Positive samples were submitted to RT-PCR to the RNA-dependent RNA-polymerase gene (RdRp) and two different RT-PCRs to the spike gene, including a typing-multiplex one. Two other RT-PCRs were used to detect the avian metapneumovirus (aMPV) and Newcastle disease virus (NDV). Avian coronavirus was found in all types of samples analyzed in quail and chickens from both type of creations, aMPV subtype B was found in chickens (Brasil) and the NDV was not observed in any samples. Based on the DNA sequences for the RdRp gene, Brazilian and Italian quail strains clustered within either Gammacoronavirus or Deltacoronavirus genus, while, for one Brazilian sample, it was detected co-infection with the two genuses. Phylogeny based on partial S1 subunit sequences showed that the gammacoronaviruses detected in the Brazilian and Italian quail belong to the Brazil type and 793/B, respectively. These results suggest that quail are susceptible to Gamma and Deltacoronavirus and that quail avian coronavirus share spike genes identical to chicken infectious bronchitis virus (IBV); thus, quail might act as reservoirs for avian coronaviruses. Also, Massachusetts vaccination was not efficient to control IBV in Brazilian quail. / Este estudo teve como objetivo pesquisar a ocorrência e diversidade molecular de coronavírus em codornas e galinhas criadas nas mesmas propriedades e em codornas criadas em propriedades isoladas, para determinar o papel das codornas como reservatório para o vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV). Para isso, duas pesquisas foram realizadas, uma em 2013, no estado de São Paulo, Sudeste do Brasil, onde algumas granjas iniciaram a vacinação em codornas contra o IBV com o sorotipo Massachusetts, após um estudo realizado em 2009-2010; e a outra, em 2015, em duas regiões do Norte da Itália. No estudo brasileiro, foram coletados pools de aparelho reprodutor, pulmões, rins, traqueia e conteúdo entérico de codornas (Coturnix coturnix japonica() e galinhas com histórico de manifestações clínicas compatíveis com a Bronquite Infecciosa das galinhas (BIG). Por outro lado, no estudo italiano, as amostras foram coletadas em forma de pools de swabs traqueais e cloacais e intestino/conteúdo entérico de codornas (Coturnix coturnix) com sinais entéricos. Estas amostras foram testadas para os coronavírus aviário (Gammacoronavirus) mediante uma semi-nested RT-PCR dirigida a região não-traduzida 3 (3´UTR). As amostras positivas foram submetidas a RT-PCR do gene codificador da proteína RNA-polimerase RNA-dependente (RdRp) e duas RT-PCRs, incluindo uma multiplex dirigidas a proteína de espícula (S) do vírus da BIG, para genotipagem. Além disso, a detecção de metapneumovírus aviário (aMPV) e o vírus da doença de Newcastle (NDV) também foi realizada por meio de RT-PCRs. Coronavírus aviários foram encontrados em todos os tipos de amostras estudadas em codornas e galinhas de todos os tipos de criações, aMPV subtipo B foi encontrado em galinhas (Brasil) e o NDV não foi encontrado em nenhuma amostras. Com base nas sequências de DNA para o gene codificador da proteína RdRp, as amostras brasileiras e italianas foram agrupadas no gênero Gamma ou Deltacoronavirus, enquanto que, em uma amostra brasileira, foi detectada coinfecção pelos dois gêneros. A filogenia com base nas sequências parciais da subunidade S1da proteína de espícula, evidenciou que os Gammacoronavirus detectados nas codornas brasileiras e italianas pertencem ao genótipo Brasil e 793/B, respectivamente. Estes resultados sugerem que as codornas são suscetíveis aos coronavírus do gênero Gamma e Delta e os coronavírus aviários das codornas compartilham genes de espícula idênticos aos do IBV. Desta forma, sugere-se que as codornas podem servir como reservatórios para coronavírus aviários e que a vacinação com o sorotipo Massachusetts não foi eficiente no controle de IBV nas codornas brasileiras.

Coronavírus, incluindo-se o Coronavírus aviário (ACoV), possuem o maior genoma composto por RNA conhecido entre os vírus. Aproximadamente dois terços desse genoma codificam proteínas não estruturais (Nsps), cujas funções parecem estar associadas à replicação e patogênese viral. Até o momento, esses alvos têm sido pouco explorados quanto a sua diversidade em diferentes linhagens de ACoV. O presente estudo teve como objetivo investigar a diversidade dos genes codificadores das proteínas não estruturais Nsp2 e protease Papaína-like (Plpro), utilizando-se linhagens brasileiras de ACoV. Para tanto, 10 linhagens de ACoV, isoladas em ovos embrionados, foram submetidas à RT-PCR direcionada aos genes codificadores de Plpro e Nsp2, seguindo-se o sequenciamento de DNA e a análise filogenética, juntamente com sequências homólogas obtidas no GenBank. Além disso, realizou-se a genotipagem por meio do sequenciamento parcial do gene codificador da proteína de espícula (região S1). Três das amostras virais obtidas e investigadas no presente trabalho apresentaram padrão de segregação discordante para os genes estudados. O isolado CRG I22 agrupou-se com linhagens virais pertencentes ao genótipo Massachusetts para S1 e com o grupamento de ACoVs brasileiros os genes da Nsp2 e Plpro. O isolado CRG I33 agrupou-se com linhagens virais pertencentes ao genótipo brasileiro para s1 e plpro e de maneira divergente para o gene da Nsp2. Para o isolado CRG I38, não foi obtida a genotipagem por s1, entretanto, similarmente ao observado para o isolado CRG I33, esse isolado agrupo-se com linhagens virais brasileiras para o gene plro e de maneira independente para o gene nsp2. As demais linhagens estudadas resultaram na formação de um grupamento especificamente brasileiro de ACoV, para os três genes estudados. Esses achados sugerem a ocorrência de recombinação nessas amostras discrepantes. Quanto às identidades médias entre as sequencias nucleotídicas analisadas, a região de s1 analisada apresentou as menores identidades (73,75% ±16,78), seguido pelo gene plpro (88,06% ±5,7) e do gene nsp2 (92,28% ±4,37), em acordo com a literatura. Assim sendo, os alvos investigados podem constituir ferramentas úteis na epidemiologia molecular do ACoV e na investigação de linhagens recombinantes do vírus. O presente estudo é o primeiro a investigar a diversidade genética de genes codificadores de proteínas não-estruturais em linhagens brasileiras de ACoV. Os resultados aqui apresentados reforçam a existência de um genótipo brasileiro de ACoV, para os 3 genes estudados. Entretanto, discrepâncias pontuais encontradas no padrão genotípico para s1, nsp2 e nsp3 permitem inferir uma diversidade genética maior do que a conhecida até o momento, possivelmente resultante de eventos de recombinação entre ACoVs brasileiros, ACoVs vacinais e outros ainda desconhecidos. Os resultados obtidos auxiliam na compreensão dos padrões e evolução dos ACoVs / Coronaviruses, including Avian coronavirus (ACoV), have the largest known RNA genome. Nearly two thirds of its genome codes for non-structural proteins (Nsps), whose functions appear to be linked to viral replication and pathogenesis. Hitherto these targets have been poorly explored regarding the ACoV lineages diversity. The present study aimed to assess the diversity of non-structural protein 2 (nsp2), papain-like protease (plpro) and spike protein (S1 subunit) coding genes, in Brazilian ACoV strains. To this end, 10 ACoV strains, isolated in embryonated eggs, had its 3rd and 5th passages submitted to RT-PCR targeting nsp2, plpro and s1, followed by DNA sequencing and phylogenetic analysis, herewith homologous sequences obtained from GenBank. Three of the ACoV strains sequenced showed a discordant segregation pattern for target genes. CRG I22 strain clustered with Massachusetts genotipe strains for S1, and with Brazilian cluster for nsp3 and plpro genes. CRG I33 strain, clustered with Brazilian strains for S1 and plpro genes, and was divergent for nsp2 gene. For CRG I38 strain, the S1 sequence was not obtained, however, similarly to what was observed for CRG I33, this strain grouped with the Brazilian lineage for plpro gene and was divergent for nsp2 gene. All the other ACoV here sequenced resulted in a specific Brazilian cluster for the three studied genes. Regarding the mean nucleotide identities measured, s1 gene showed the lowest identity (73.75% ±16.78), followed by plpro gene (88.06% ±5.7) and nsp2 gene (92.28% ±4.37), in accordance with previous reported data. Therefore, the targets of the present study are useful tools for ACoV molecular epidemiology studies and for the survey of recombinant ACoV strains. The presented study is the first one investigating the molecular diversity of non-structural proteins coding genes in Brazilian strains of ACoV. Results achieved herein reinforce the data over the circulation of ACoV Brazilian strains in this country, for the three investigated genes. However, divergences found between S1, nsp2 and plpro genetic patters allow inferring a higher molecular diversity than previously known. It is possible that this divergence is due to recombination events between ACoV from vaccines, Brazilian field strains and others still unknown. These results contribute on the comprehension over genetic patters and evolution of ACoV

Coronavírus, incluindo-se o Coronavírus aviário (ACoV), possuem o maior genoma composto por RNA conhecido entre os vírus. Aproximadamente dois terços desse genoma codificam proteínas não estruturais (Nsps), cujas funções parecem estar associadas à replicação e patogênese viral. Até o momento, esses alvos têm sido pouco explorados quanto a sua diversidade em diferentes linhagens de ACoV. O presente estudo teve como objetivo investigar a diversidade dos genes codificadores das proteínas não estruturais Nsp2 e protease Papaína-like (Plpro), utilizando-se linhagens brasileiras de ACoV. Para tanto, 10 linhagens de ACoV, isoladas em ovos embrionados, foram submetidas à RT-PCR direcionada aos genes codificadores de Plpro e Nsp2, seguindo-se o sequenciamento de DNA e a análise filogenética, juntamente com sequências homólogas obtidas no GenBank. Além disso, realizou-se a genotipagem por meio do sequenciamento parcial do gene codificador da proteína de espícula (região S1). Três das amostras virais obtidas e investigadas no presente trabalho apresentaram padrão de segregação discordante para os genes estudados. O isolado CRG I22 agrupou-se com linhagens virais pertencentes ao genótipo Massachusetts para S1 e com o grupamento de ACoVs brasileiros os genes da Nsp2 e Plpro. O isolado CRG I33 agrupou-se com linhagens virais pertencentes ao genótipo brasileiro para s1 e plpro e de maneira divergente para o gene da Nsp2. Para o isolado CRG I38, não foi obtida a genotipagem por s1, entretanto, similarmente ao observado para o isolado CRG I33, esse isolado agrupo-se com linhagens virais brasileiras para o gene plro e de maneira independente para o gene nsp2. As demais linhagens estudadas resultaram na formação de um grupamento especificamente brasileiro de ACoV, para os três genes estudados. Esses achados sugerem a ocorrência de recombinação nessas amostras discrepantes. Quanto às identidades médias entre as sequencias nucleotídicas analisadas, a região de s1 analisada apresentou as menores identidades (73,75% ±16,78), seguido pelo gene plpro (88,06% ±5,7) e do gene nsp2 (92,28% ±4,37), em acordo com a literatura. Assim sendo, os alvos investigados podem constituir ferramentas úteis na epidemiologia molecular do ACoV e na investigação de linhagens recombinantes do vírus. O presente estudo é o primeiro a investigar a diversidade genética de genes codificadores de proteínas não-estruturais em linhagens brasileiras de ACoV. Os resultados aqui apresentados reforçam a existência de um genótipo brasileiro de ACoV, para os 3 genes estudados. Entretanto, discrepâncias pontuais encontradas no padrão genotípico para s1, nsp2 e nsp3 permitem inferir uma diversidade genética maior do que a conhecida até o momento, possivelmente resultante de eventos de recombinação entre ACoVs brasileiros, ACoVs vacinais e outros ainda desconhecidos. Os resultados obtidos auxiliam na compreensão dos padrões e evolução dos ACoVs / Coronaviruses, including Avian coronavirus (ACoV), have the largest known RNA genome. Nearly two thirds of its genome codes for non-structural proteins (Nsps), whose functions appear to be linked to viral replication and pathogenesis. Hitherto these targets have been poorly explored regarding the ACoV lineages diversity. The present study aimed to assess the diversity of non-structural protein 2 (nsp2), papain-like protease (plpro) and spike protein (S1 subunit) coding genes, in Brazilian ACoV strains. To this end, 10 ACoV strains, isolated in embryonated eggs, had its 3rd and 5th passages submitted to RT-PCR targeting nsp2, plpro and s1, followed by DNA sequencing and phylogenetic analysis, herewith homologous sequences obtained from GenBank. Three of the ACoV strains sequenced showed a discordant segregation pattern for target genes. CRG I22 strain clustered with Massachusetts genotipe strains for S1, and with Brazilian cluster for nsp3 and plpro genes. CRG I33 strain, clustered with Brazilian strains for S1 and plpro genes, and was divergent for nsp2 gene. For CRG I38 strain, the S1 sequence was not obtained, however, similarly to what was observed for CRG I33, this strain grouped with the Brazilian lineage for plpro gene and was divergent for nsp2 gene. All the other ACoV here sequenced resulted in a specific Brazilian cluster for the three studied genes. Regarding the mean nucleotide identities measured, s1 gene showed the lowest identity (73.75% ±16.78), followed by plpro gene (88.06% ±5.7) and nsp2 gene (92.28% ±4.37), in accordance with previous reported data. Therefore, the targets of the present study are useful tools for ACoV molecular epidemiology studies and for the survey of recombinant ACoV strains. The presented study is the first one investigating the molecular diversity of non-structural proteins coding genes in Brazilian strains of ACoV. Results achieved herein reinforce the data over the circulation of ACoV Brazilian strains in this country, for the three investigated genes. However, divergences found between S1, nsp2 and plpro genetic patters allow inferring a higher molecular diversity than previously known. It is possible that this divergence is due to recombination events between ACoV from vaccines, Brazilian field strains and others still unknown. These results contribute on the comprehension over genetic patters and evolution of ACoV