Le cil primaire, véritable organite sensoriel cellulaire est présent à la surface de la plupart des cellules de mammifères en quiescence. Truffé de récepteurs à sa membrane, le cil capte les signaux mécaniques et chimiques, jouant ainsi un rôle clé dans de nombreux processus développementaux et physiologiques. Un défaut de structure et/ou de fonction du cil est à l'origine de cancérogénèse et de pathologies humaines appelées ciliopathies.Le cil primaire est ancré à la membrane plasmique grâce au corps basal, structure dérivée du centriole père et connectée aux trois réseaux du cytosquelette. La formation du cil primaire nécessite une succession d'étapes cytoplasmiques hautement régulées. Elle débute par la maturation du centriole père en corps basal. Cette étape nécessite le recrutement de protéines spécifiques au centriole père permettant l'association avec une vésicule ciliaire à l'extrémité distale du centriole père. Ce complexe migre et vient s'ancrer à la membrane apicale déclenchant la nucléation de microtubules pour la formation de la partie externe du cil, ou axonème. En parallèle, la ciliogénèse nécessite un remodelage important du cytosquelette d'actine ainsi qu'un trafic de vésicules orienté vers la base du cil. Si la plupart des étapes sont bien caractérisées, celle concernant la migration du corps basal ainsi que la contribution du cytosquelette reste mal comprise.Afin de mieux appréhender les mécanismes impliqués dans la migration du corps basal lors de la ciliogénèse, nous avons développé un système expérimental basé sur l'utilisation de micro-patrons adhésifs recouverts de fibronectine. Cette technologie comporte de nombreux avantages. Elle permet le contrôle de l'étalement de la cellule inhérent à la surface imposée par la matrice extracellulaire régulant ainsi l'organisation du cytosquelette ainsi que le positionnement des organelles subcellulaires. Par ailleurs, le volume cellulaire induit par le confinement spatial facilite l'observation de la position du centrosome en z au cours du temps, indispensable pour l'étude de chaque étape de la ciliogénèse cytoplasmique.Dans un premier temps, nous avons démontré que la forme et l'architecture du cytosquelette d'actine qui en dépend sont des régulateurs majeurs du processus ciliogénique. Les cellules confinées spatialement et sevrées 24h sur des petits disques développent un réseau branché au niveau de leur surface apicale nécessaire à la croissance du cil primaire. A l'inverse, les cellules étalées sur des grands disques sont beaucoup plus contractées. Elles développent d'importantes fibres de stress sur leur surface ventrale. Le centrosome reste sous le noyau et le niveau de contraction empêche l'assemblage du cil. Le niveau de contractilité module donc la formation du réseau d'actine apicale qui contrôle en retour le mouvement du corps basal et l'élongation du cil.Dans un deuxième temps, nous avons étudié la dynamique du cytosquelette d'actine et de microtubules durant l'étape de migration du corps basal c'est à dire juste après la privation de sérum. Nos résultats indiquent que la migration nécessite une augmentation transitoire de la stabilité des microtubules concomitante avec une augmentation de la contractilité des filaments d'actine. Un crible basé sur l'ARN interférence nous a permis d'identifier des gènes impliqués dans le processus de migration dont CEP164, contribuant à l'ancrage du centriole père à la vésicule ciliaire. Les cellules déficientes en CEP164 montrent un défaut de réorganisation du cytosquelette expliquant l'inhibition du transport du corps basal vers la membrane apicale.L'ensemble des résultats nous permet d'avancer dans la compréhension des conditions requises pour le mouvement du corps basal vers la membrane apicale. Celui-ci nécessite à la fois un remodelage significatif du cytosquelette en constant dialogue et en interaction avec certains composants ciliaires nécessaires à la formation du cil primaire. / The primary cilium is a sensory organelle present on the surface of most quiescent cells. It possesses numerous receptors on its surface and is responsible for transducing biochemical and mechanical signals to the interior of the cell and playsimportant roles during development and in homeostasis. Defects in primary cilium assembly are the underlying cause of a group of pleiotropic diseases referred to as ciliopathies.The primary cilium is anchored to the plasma membrane through the basal body which is derived from the mother centriole and is connected to three networks of the cytoskeleton. Primary cilium formation is a highly regulated and multi-step process that begins with the maturation of the centriole mother into basal body in the cytoplasm of the cell. One of the first steps of primary cilium assembly is the recruitment of specific proteins to the mother centriole to initiate the formation of a ciliary vesicle at the distal end of the mother centriole. Once formed, the mother centriole migrates to and is anchored to the apical membrane, triggering the elongation of microtubules from the distal end of the mother centriole to form the outer part of primary cilium, or axoneme. In order for this to occur, significant remodeling of the actin cytoskeleton and directe-trafficking of vesicles to the base of the cilium is required. While much progress has been made in characterizing the initial steps of primary ciliogenesis, how the basal body migrates to the plasma membrane is not fully understood.To gain a better understanding of the mechanisms involved in the migration of basal body during ciliogenesis, we developed an experimental system based on the use of adhesive micro-patterns coated with fibronectin. This technology has many advantages. It enables the control of the cell spreading which is imposed by the size of the adhesive area and, in turn, the regulation of cytoskeletal organization and the positioning of subcellular organelles. Furthermore, this technique enables the cell volume induced by the spatial confinement, to be controlled, facilitating the observation and measurement of the centrosome's position in z throughout the primary ciliogenesis process.First, we demonstrated that the shape and architecture of the actin cytoskeleton are major regulators of primary ciliogenesis. Cells spatially confined and starved for 24h on small discoidal micropattern develop an apical web like actin network necessary for the primary cilium growth. In contrast, cells plated on large discs are much more contracted and they develop significant stress fibers on their ventral surface. In this situation, the centrosome remains below the nucleus and the level of contraction prevents the assembly of a primary cilium. The level of contractility therefore modulates the formation of apical actin network that in turn controls the movement of the basal body and the cilium elongation.Secondly, we studied actin cytoskeleton and microtubule reorganization during the basal body migration step that occured just after serum starvation. Our results indicate that migration requires a transient increase in the stability of microtubules, concomitant with an increase in contractility of actin filaments. By RNA interference screening, we have identified genes involved in the migration process including CEP164, which has previously been shown to participate in the anchoring of the ciliary vesicle to the mother centriole. CEP164-deficient cells were found to have defects in cytoskeletal reorganization thereby explaining why basal body transport to the plasma membrane was blocked in these cells.Altogether, these results enable our understanding of how basal body movement to the apical membrane is driven. This requires both significant remodeling and crosstalk between the actin and microtubule cytoskeleton and interaction with ciliary components necessary for the formation of a primary cilium.

Les cils sont des organites conservés au cours de l’évolution émanant de corps basaux et qui, motiles ou non, jouent des rôles essentiels dans de nombreux processus physiologiques. Leur formation est conditionnée par le positionnement et l’ancrage correct des corps basaux à la surface cellulaire. Chez la paramécie, trois protéines conservées, FOR20, Centrine 2 et Centrine 3 recrutées séquentiellement jouent un rôle dans ce processus d’ancrage. J’ai réalisé l’analyse fonctionnelle de deux autres protéines évolutivement conservées OFD1 et VFL3 susceptibles d’être impliquées dans cet ancrage. L’analyse d’OFD1 a été également dictée par le fait que sa fonction dans l’assemblage des cils motiles demeurait peu étudiée. Dans l’espèce Paramecium tetraurelia, qui a subi au moins trois duplications globales de son génome au cours de l’évolution, un seul gène code la protéine OFD1 tandis que deux familles VFL3-A et VFL3-B coexistent. La déplétion des protéines de la famille VFL3-B n’ayant pas produit d’effet je n’ai pas pu leur attribuer une fonction mais une de ses isoformes se localise au niveau des corps basaux. Bien qu’OFD1 et les protéines VFL3-A soient impliquées dans le positionnement et l’ancrage des corps basaux, les mécanismes dans lesquels elles interviennent sont différents. Pour OFD1 les défauts d’ancrage étaient associés à des anomalies de formation de la partie distale des corps basaux, ce qui est en accord avec la fonction connue de cette protéine dans l’assemblage des appendices distaux des corps basaux des cils primaires. Elle se localise au niveau de la zone de transition entre les doublets de microtubules et la membrane ciliaire. Les recrutements d’OFD1 et FOR20 au sein des corps basaux sont interdépendants alors qu’il n’y a pas de relation entre le recrutement d’OFD1 et celui de la Centrine 2. Ces observations démontrent une conservation fonctionnelle de la protéine OFD1 dans les mécanismes d’ancrage des cils motiles et précisent ses relations avec FOR20 et Centrine 2. Outre les défauts d’ancrage, la déplétion des deux isoformes VFL3-A induit une distribution anarchique des racines striées qui constituent des marqueurs de leur polarité rotationnelle. Ceci suggère que ces protéines sont impliquées dans l’établissement de cette polarité. Cette polarité étant indispensable au positionnement correct des différents appendices qui guident le mouvement des corps basaux néoformés vers la surface cellulaire, son altération pourrait expliquer les défauts d’ancrage observés. Une isoforme de VFL3-A se localise transitoirement à l’extrémité proximale des corps basaux pères à un stade précoce de leur duplication entre la racine striée et les microtubules auxquels elles sont associées. Cette protéine pourrait donc constituer un facteur extrinsèque contrôlant la polarité du corps basal. L’ensemble de ces résultats souligne la complexité du mécanisme d’ancrage des corps basaux chez cet organisme qui est conditionné non seulement par un assemblage correct de leur extrémité distale mais également par celui de ses structures associées en partie proximale. / Cilia are evolutionary conserved organelles developing from basal bodies and which play essential roles in many physiological processes. Their development depends upon a correct anchoring of basal bodies at the cell surface. In Paramecium, three conserved proteins, FOR20, Centrin 2 and Centrin 3, sequentially recruited are required for the anchoring process. I analyzed the function of two others conserved proteins, OFD1 and VFL3, likely involved in the anchoring process. In particular, the role of OFD1 in motile cilia biogenesis had not been really studied yet. In P. tetraurelia, which has undergone at least three global genome duplications, a single gene encodes OFD1, while two families VFL3-A and VFL3-B coexist. Depletion of the VFL3-B proteins produced no effect, but VFL3-3 was localized at the basal bodies. Although OFD1 and the VFL3-A proteins are both involved in the positioning and anchoring of the basal bodies, they participate in different mechanisms. Concerning OFD1, the anchoring defects reflected defects in basal body distal part assembly, in agreement with its known role in the assembly of the distal appendages of primary cilia. It localizes in the transition zone, between the microtubule doublets and the ciliary membrane. The recruitment of OFD1 and FOR20 to the basal bodies is interdependent, while OFD1 and Centrin2 were not. These observations demonstrate the conserved role of OFD1 in the anchoring mechanisms in motile cilia and clarify its relations with FOR20 and Centrin 2. In addition to the anchoring defects, depletion of the two VFL3-A isoforms causes an anarchic distribution of the striated rootlets which mark the rotational polarity of basal bodies. This suggests that these proteins are involved in the establishment of this polarity, required for the correct positioning of the different appendages which guide the neoformed basal bodies towards the cell surface. One isoform of VFL3-A is transiently localizes at the proximal tip of the mother basal body, at an early stage of its assembly, between the striated rootlet and the microtubules to which they are associated. VFL3-1 might then be an extrinsic polarity factor for the basal body. Altogether, these results underscore the complexity of the anchoring process which requires not only the correct assembly of the distal part but also of the proximal appendages in Paramecium.