Le cilié Paramecium tetraurelia est un modèle intéressant pour l'étude de la diversité et de l'évolution des voies d'ARN interférence (ARNi) chez les eucaryotes. L'une des voies d'ARNi végétatives peut être induite en nourrissant les paramécies de bactéries produisant un ARN double-brin (ARNdb) homologue à un gène donné, dont l'expression est inactivée de manière post-transcriptionnelle par la production de siARN de 23 nt. Un crible de mutagénèse a permis d'obtenir des mutants mendéliens déficients pour l'ARNi, dont les génomes ont été séquencés afin d'identifier sans a priori des gènes impliqués dans cette voie. 6 gènes ont été identifiés: un Dicer, deux ARN polymérases ARN-dépendantes (RDR1 et 2), une nucléotidyl-transférase (CID1) et deux gènes codant de nouvelles protéines (PDS1 et 2). Pour étudier leur rôle dans la biosynthèse ou l'action des siARN, ces derniers ont été séquencés à partir de cellules sauvages ou mutantes, nourries d'un ARNdb homologue à un gène non essentiel. L'analyse bio-informatique a montré que des siARN dits 'primaires' sont produits à partir de l'ARNdb bactérien, tandis que des siARN dits 'secondaires' sont produits à partir de la totalité de l'ARNm endogène ciblé, et sont majoritairement de polarité anti-sens. Alors que la production des siARN primaires dépend de tous les gènes étudiés, les résultats n'impliquent que RDR2 dans celle des siARN secondaires. Enfin, j'ai montré que certains clusters de siARN endogènes dépendent de RDR1 et de CID1, tandis que d'autres dépendent de RDR2. La paramécie produit également des siARN antisens aux ARN ribosomaux bactériens, suggérant de nouvelles hypothèses quant à la fonction naturelle de cette voie. / The ciliate Paramecium tetraurelia is an interesting model to study the diversity and evolution of RNA interference (RNAi) pathways. One of the vegetative RNAi pathways is induced by feeding cells with bacteria producing double-stranded RNA (dsRNA) homologous to a given gene, which is then post-transcriptionally silenced through the production of 23-nt siRNAs. A forward genetic screen allowed us to obtain Mendelian mutants deficient in dsRNA-induced RNAi, and mutated genes were identified by whole-genome resequencing. 6 genes were identified: one Dicer, two RNA-dependent RNA polymerases (RDR1 et 2), one nucleotidyl-transferase (CID1) and two genes encoding novel poteins (PDS1 and 2). To study their roles in siRNA biosynthesis or action, we sequenced small RNAs from wild-type or mutants cells fed with a dsRNA homologous to a non-essential endogenous gene. Bioinformatic analyses showed that 'primary' siRNAs are produced from the bacterial dsRNA trigger, while 'secondary' siRNAs, predominantly of antisense polarity, are produced from the whole length of the targeted endogenous mRNA. While primary siRNA production requires all of the genes studied, the results only implicate RDR2 in the production of secondary siRNAs. Finally, I showed that some clusters of endogenous siRNAs depend on RDR1 and CID1, whereas others depend on RDR2. Paramecium was also shown to produce siRNAs that are antisense to bacterial ribosomal RNAs, suggesting new hypotheses about the possible natural functions of this pathway.

Chez Drosophila melanogaster, l’orientation horaire (dextrale) des organes est déterminée par un gène unique codant la Myosine non conventionnelle de type ID (MyoID). Un crible génétique modificateur en contexte sensibilisé pour myoID nous a permis d’identifier klp64D comme un gène interagissant génétiquement avec myoID. Celui-ci code l’une des sous-unités motrices du complexe moteur hétérotrimérique Kinésine-2 (Kin-2) constitué d’une autre sous-unité motrice Klp68D et d’une sous-unité adaptatrice Kap3. Nous montrons que klp68D interagit génétiquement avec myoID lors de la mise en place de l’axe D/G. Ceci suggère donc un rôle de l’ensemble du complexe Kin-2 dans l’asymétrie D/G. Chez les vertébrés, Kin-2 participe à l’assemblage des cils impliqués dans la détermination D/G lors de la gastrulation. Or, chez la drosophile, les cils ne sont pas requis dans la détermination D/G. MyoID et Kin-2 sont requis de manière synchrone dans la voie dextrale lors de la détermination D/G. En outre, Kin-2 joue un rôle important dans la rotation horaire du génitalia et l’enroulement dextral de l’intestin postérieur adulte (hindgut). Kin-2 est requise dans l’organisateur D/G de l’hindgut adulte pour l’orientation biaisée des cellules qui n’expriment pas MyoID. Par ailleurs, nos résultats suggèrent que l’activité de Kin-2 n’est pas requise dans le sous-ensemble de cellules qui exprime MyoID. Enfin, le rôle joué par Kin-2 dans l’asymétrie D/G semble indépendant de la polarité apico-basale et des jonctions adhérentes. Kin-2 pourrait donc jouer un rôle non ciliaire dans la phase de propagation de l’information directionnelle induite par MyoID. / In nature most of the bilateralia are left/right (L/R) asymmetric. In Drosophila, asymmetry is apparent in the directional looping of gut and terminalia. Dextral orientation of organs is controlled by the activity of a single gene myosin ID (myoID) whose mutation induces a fully inverted L/R axis. To date little is known of how the initial L/R cue induced by MyoID is propagated and maintained through the rest of the architecture of the L/R organizer. Here we present the identification of klp64D and klp68D as new myoID interacting genes. These genes encodes the two motor sub-units of the Drosophila Kinesin-2 motor complex. Interestingly, this microtubule-based motor plays a ciliary function in vertebrate L/R morphogenesis. However, we show that in Drosophila cilia are not involved in L/R asymmetry. We demonstrate that Kinesin-2 acts during L/R determination in the dextral pathway. Furthermore Kinesin-2 is required for proper L/R patterning both of male genitalia and of adult hindgut. L/R activity of Kinesin-2 is restricted to cells that do not express MyoID suggesting a role for this motor in propagation of the L/R cue. Our findings show for the first time a non ciliary role for Kinesin-2 in L/R axis determination. Thus, these results shed light on an evolutionary conservation between Drosophila and vertebrate L/R determination.

Une des caractéristiques définissant les êtres vivants est leur capacité à se reproduire. La reproduction sexuée est le mécanisme qui a encouragé la sélection positive des espèces au cours de l’évolution en augmentant leurs diversités génétiques. Lors de leurs reproductions les angiospermes (les plantes à fleurs) utilisent un organe sexuel appelé fleur. Le sexe de cet organe est déterminé par la présence ou l’absence de deux différents types de tissus reproducteurs. Le tissu reproducteur mâle est appelé étamine et porte le pollen. Le tissu reproducteur femelle est appelé pistil et est constitué d’un ou plusieurs carpelles. La labilité sexuelle et l’importance économique des Cucurbites comme Cucumis melo (le melon), Cucumis sativus (le concombre) et Citrullus lanatus (la pastèque) ont fait d’eux des organismes-modèles pour l’étude du déterminisme du sexe contrôlé par un réseau génétique. Le modèle génétique du déterminisme du sexe de Cucumis melo peut être expliqué par la modulation et l’interaction de trois gènes: CmACS-7, CmWIP1, CmACS11. Le gène CmACS-7 est situé au locus M et code une enzyme de biosynthèse de l’éthylène (Boualem et al 2008) réprimant le développement des étamines. Le gène CmWIP1 est situé au locus G et code un facteur de transcription potentiel réprimant le développement du carpelle (Martin and al 2010). Et le gène CmACS11 est situé au locus A et code une enzyme de biosynthèse de l’éthylène réprimant l’expression de CmWIP1 (Boualem et al 2015). Au vu de la croissance de la population mondiale, il est nécessaire d’élargir le nombre d’outils génétiques permettant l’amélioration de la sélection variétale des plantes cultivées dont font partie les Cucurbites. La plupart des plantes hybrides sont issues d’un croisement entre deux plantes différentes, une plante mâle et une plante femelle. Pour améliorer la production de ces hybrides, il est primordial de connaître le sexe des plantes parentes et particulièrement celui des lignées femelles. Dans cette optique, les sélectionneurs ont besoin d’élargir leurs panels d’allèles permettant le contrôle du développement du carpelle. L’ingénierie de ces allèles permettra de générer des plantes gynoïques portant uniquement des fleurs femelles mais aussi d’augmenter la proportion de fleurs pistillées et de contrôler le délai d’apparition des fleurs pistillées. Ces améliorations de la sélection variétale des Cucurbites pourraient générer des alternatives aux mécanismes de stérilité mâle, de castration manuelle ou chimique. Ainsi qu’une meilleure maîtrise de l’apparition de l’effet nid, générant des plantes potentiellement plus compactes et plus rapidement productives. La manipulation des mécanismes, régulés par CmWIP1 et contrôlant le développement du pistil, pourrait permettre d’identifier de nouveaux allèles impliqués dans le développement du carpelle. Mes travaux de recherche se sont appuyés sur la mise en œuvre d’un crible génétique afin d’identifier les membres du réseau génétique auquel appartient CmWIP1, l’unique gène identifié à ce jour contrôlant le développement du carpelle chez C. melo. Ma thèse a eu pour but d’identifier des gènes suppresseurs de la fonction de TT1 (AtWIP1) et de NTT (AtWIP2), deux membres de la famille WIP chez Arabidopsis thaliana. Ces mutations suppresseurs pourront supprimer les phénotypes d’arrêt de croissance et de sénescence induits par la surexpression de TT1 ou de NTT. Pour cela, j’ai généré une population de lignées d’Arabidopsis thaliana surexprimant de manière inductible les séquences codantes de TT1 ou NTT et ayant subi une mutagenèse à l’EMS. J’ai ensuite criblé cette population pour identifier les plantes suppresseurs et les mutations causales. Mon projet de recherche a permis d’identifier quatre locus potentiellement impliqués dans le contrôle du développement du carpelle. La caractérisation de ces locus pourra aboutir à un meilleur contrôle du déterminisme du sexe des Cucurbites et des plantes possédant un mécanisme similaire. / One of the characteristics of living organisms is the ability to reproduce themselves. Sexual reproduction is a mechanism that increases the potential diversity of species and their positive selection. To reproduce most of plants species use a type of sexual organ named flower. The sex of this organ is determined by the presence or absence of two different types of reproductive tissue. The stamen is the male reproductive tissue and the carpel is (the female reproductive tissue). In many species the development of these tissues is controlled by a network of genes. Cucumis melo (melon) is a model plant to study genetic network controlling sex determination. Melon sex determination genetic model can be explained by the modulation of three genes. The gene CmACS-7 at the locus M which encodes for an ethylene biosynthesis enzyme that represses stamen development (Boualem and al 2008). The gene CmWIP1 at the locus G which encodes a putative transcription factor that represses carpel development (Martin and al 2010). And the gene CmACS11 at the locus A which encode for an ethylene biosynthesis enzyme that represses CmWIP1 expression (boualem et al 2015). The aim of this thesis project is to understand in which biological process cmWIP1 is involved to inhibit carpel development. The identification of the precise function of cmWIP1 will lead to the identification of new putative alleles controlling carpel development and sex determination. To achieve this goal we set up a genetic screen in Arabidopsis thaliana to unravel genetic interactors of CmWIP1. At the present moment we found four putative genetic interactors. These putative candidates will be tested in melon. Plants that are mutated in theses cmWIP1 genetic interactors should harbour female organ inside each of their flowers. Then the introgression of these alleles in crop species may increase fruit and/or seed yields.