Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-01-23T18:34:17Z No. of bitstreams: 1 livia_a_uehara_ioc_bcm_0025_2010.pdf: 1818827 bytes, checksum: 724191daedddb70c3dec8a0449f18b96 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-23T18:34:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 livia_a_uehara_ioc_bcm_0025_2010.pdf: 1818827 bytes, checksum: 724191daedddb70c3dec8a0449f18b96 (MD5) Previous issue date: 2010 / instituro / A cruzipaína é a cisteína peptidase mais abundante do Trypanosoma cruzi, o qual é o agente etiológico da doença de Chagas. A cruzipaína é um importante fator de virulência do T. cruzi envolvida em várias etapas cruciais na interação com células de mamíferos. Essa enzima é expressa em níveis variáveis em todas as formas evolutivas e cepas do parasito, sendo abundantemente expressa nas formas epimastigotas, encontradas apenas no inseto vetor. Esse dado nos levou a investigar se a cruzipaína poderia estar envolvida na interação do T. cruzi com células do hospedeiro invertebrado. Para tal, foram analisados os efeitos do pré-tratamento do T. cruzi com um painel de diferentes inibidores de cisteína peptidases ou anticorpos anti-cruzipaína na adesão do parasito ao epitélio intestinal médio posterior dissecado de Rhodnius prolixus. Paralelamente, foi analisado o índice de adesão ao epitélio do T. cruzi que superexpressa a chagasina (pCHAG), um inibidor endógeno da cruzipaína. A taxa de adesão dos parasitos tratados com os inibidores de cisteína peptidase (iodoacetamida, leupeptina, antipaína ou E-64 a 10 µM, ou cistatina a 1 µg/mL) foi em média 70% inferior em comparação aos parasitos não tratados, com exceção do Ca074me (um inibidor de catepsina B) que não mostrou alteração significativa. O tratamento de parasitos com a cistatina apresentou um efeito dose-dependente sobre a taxa de adesão em relação aos parasitos não tratados. Além disso, o tratamento de epimastigotas com anticorpos anti-cruzipaína (1:1000) induziu uma redução significativa de 64% na adesão. Os parasitos pCHAG apresentaram baixa capacidade de ligação ao epitélio intestinal dissecado de R. prolixus, enquanto o pTEX ( plasmídeo sem o gene inserido) não apresentou mudanças significativas na taxa de adesão em relação ao controle. Nós também comparamos a habilidade de vários isolados de T. cruzi na adesão ao intestino do R. prolixus. A cepa G, que naturalmente apresenta baixíssimos níveis de cruzipaína ativa, apresentou baixa capacidade de interação em comparação às cepas Dm28c, Y e CL Brener. Os intestinos pré-tratados com cruzipaína ativa não produziram uma redução significativa no índice de adesão às células epiteliais do inseto vetor em relação ao controle indicando que o envolvimento da cruzipaína no processo de interação é independente de interação ligante-receptor. A cruzipaína ativa na concentração de 1,5 µg/µL restaurou parcialmente (30%) o nível de adesão do T. cruzi pCHAG ao epitélio intestinal dissecado de R. prolixus em relação a parasitos pCHAG. Ensaios de colonização in vivo revelaram que parasitos pCHAG são virtualmente incapazes de colonizar a ampola retal de R. prolixus. Além disso, a expressão da cruzipaína em células de T. cruzi teve um aumento drástico após a passagem em R. prolixus. Coletivamente, nossos resultados sugerem que a cruzipaína participa ativamente da interação entre T. cruzi e células epiteliais do hospedeiro invertebrado, através de um mecansimo distinto ao de ligante-receptor. / Cruzipain is the most abundant cysteine peptidase of Trypanosoma cruzi, which is the causative agent of Chagas’ disease. The cruzipain is an important virulence factor of T. cruzi, involved in several crucial steps in the interaction with mammalian cells. This enzyme is expressed at variable levels in all developmental forms and strains of the parasite, being abundantly expressed in epimastigotes forms, found only in the insect vector. This finding led us to investigate whether cruzipain could be involved in the interaction of T. cruzi with invertebrate host cells. To this end, we have analyzed the effects of the treatment of T. cruzi with a panel of different cysteine peptidase inhibitors or anti-cruzipain antibodies on the parasite adhesion to Rhodnius prolixus posterior dissected midgut. In parallel, we have analyzed the adhesion rate of T. cruzi that superexpresses chagasin (pCHAG), an endogenous cruzipain inhibitor. The adhesion rate of parasites treated with cysteine peptidase inhibitors (iodoacetamide, leupeptin, antipain or E-64 at 10 µM or cystatin at 1 µg/mL) was, in average, 70% lower compared to untreated parasites, except for Ca074me (an inhibitor of cathepsin B) that showed no significant change. Parasites treated with cystatin showed a dose-dependent effect. Furthermore, epimastigotes treated with anti-cruzipain (1:1000) presented a significant reduction of 64% in adhesion. pCHAG parasites showed low ability to bind to intestinal epithelium. We also compared the ability of several T. cruzi isolates to adhere to R. prolixus. The G strain, which naturally possesses low levels of active cruzipain, adhered to a lesser extent in comparison to Dm28c, Y and CL Brener strains. The intestines pre-treated with active cruzipain did not produce a significant reduction in the adhesion rate to epithelial cells of the insect vector as compared to control, suggesting that the involvement of cruzipain in the interaction process is independent of a ligant-receptor interaction. The active cruzipain at 1,5 µg/µL partially restored (30%) the adherence level of T. cruzi pCHAG to Rhodnius prolixus posterior dissected midgut in comparsion to pCHAG parasites. In vivo infection assays, revealed that pCHAG parasites were virtually unable to colonize R. prolixus rectum. Furthermore, the expression of surface cruzipain in T. cruzi cells was drastically enhanced after the passage in R. prolixus. Collectively, these results suggest that cruzipain mediates actively the interaction between T. cruzi and epithelial cells of the invertebrate host through a distint mechanism of the ligant-receptor.