A la suite d’un criblage in silico nous avons identifié un nouveau gène codant pour une protéine à domaine BTB-POZ, XBTBD6. Nous avons déterminé que la protéine XBTBD6 est une protéine cytoplasmique. Dans les cellules Hela, CHO, U2OS et COS7 la protéine XBTBD6 est localisée dans des corpuscules cytoplasmiques, localisation similaire à celle des protéines XBTBD3, HBTBD1 et HBTBD2. Nous avons observé que la partie N-terminale de la protéine, contenant le domaine BTB-POZ, est localisée dans la cellule comme la protéine entière ; par contre la partie C-terminale est exclusivement nucléaire. De plus, nous avons observé que XBTBD6 est localisée de façon diffuse dans le cytoplasme des cellules Neuro2A, 9L et 518A2e. Nous avons montré que la protéine XBTBD6 homodimérise et hétérodimérise avec XBTBD3 et XBTBD2 et qu’elle interagit avec l’ubiquitine ligase E3 XCullin 3. L’ensemble de ces interactions nécessite la présence du domaine BTB-POZ. Ces données montrent que les protéines BTBD6, BTBD3, BTBD1 et BTBD2 possèdent des propriétés communes indiquant qu’elles appartiennent à un sous groupe de la famille des protéines à domaine BTB-POZ. Le profil d’expression a été analysé par la technique de protection à la RNAse et par hybridation in situ. Les résultats montrent que ce gène est fortement exprimé dans le système nerveux adulte et embryonnaire. Des expériences de surexpression par micro-injection d’ARNm ont permis de placer le gène XBTBD6 dans la cascade d’activation des gènes proneuraux en aval de XNgnr-1, XNeuroD, Xath3 et Xebf3. Ces résultats montrent que XBTBD6 est un marqueur neuronal chez le xénope. Au cours de l’étude de la fonction du gène XBTBD6, nous avons montré que la surexpression et la perte de fonction de ce gène dans l’embryon de xénope n’induit pas de variation du nombre de neurones dans la plaque neurale. Par contre nous avons observé que la surexpression du gène XBTBD6 dans des cellules Neuro2A en différentiation régule négativement la croissance des neurites. Nous avons élaboré un modèle de fonctionnement biochimique hypothétique où la protéine XBTBD6 fonctionnerait comme protéine adaptatrice dans un complexe d’ubiquitination permettant l’ubiquitination d’une protéine cible. Nous avons recherché les partenaires potentiels de XBTBD6 en utilisant la technique du double hybride en levure mais sans y parvenir.

The need for anabolic therapies to increase bone formation in difficult orthopaedic circumstances and to treat osteoporosis is an area of intense research focus. There is a current interest in the Wnt signalling pathway as a target for such treatment, with accumulating evidence for a role of this pathway in bone formation. Ectoderm Neural Cortex 1 (ENC1) is a Wnt target gene, not previously studied in bone, which was observed in our laboratory to be up-regulated in an anabolic surgical model of bone formation. The involvement of ENC1 in the differentiation of neuronal and adipocytic cells has previously been reported; therefore, this thesis investigates the expression of ENC1 in cells of the bone and the role of ENC1 during osteoblast differentiation. ENC1 transcript expression was localised to osteoblastic, chondrocytic and osteocytic cells in sections of healing fracture callus and normal mouse bone by in situ hybridisation. The expression of ENC1 was confirmed in differentiating primary osteoblasts and in osteoblastic and osteosarcoma cell lines by quantitative real time PCR and western blotting. ENC1 exists as two protein isoforms of 67 and 57kD in size, which are translated from alternatively spliced ENC1 transcripts. Both isoforms of the protein were detected in differentiating cultures of the pre-osteoblast cell line MC3T3-E1. To address the function of ENC1 in osteoblast differentiation, shRNA knockdown of the endogenous transcript was undertaken in MG63 osteosarcoma cells and in the MC3T3-E1 pre-osteoblastic differentiation model. Stable expression of shRNA targeted to both ENC1 spliceforms resulted in reduced accumulation of alkaline phosphatase positive nodules and alkaline phosphatase transcripts in MG63 cell culture. This reduction was not seen with targeted knockdown of 67kD ENC1 alone. Stable tetracycline-inducible shRNA knockdown targeted to both 57 and 67kD ENC1 isoforms in MC3T3-E1 cells resulted in a significant reduction of Alizarin Red S stained mineralised nodules. When expression of 67kD ENC1 alone was reduced, however, a significant increase in MC3T3-E1 nodule formation was observed. This knockdown had no effect on the expression of early genes involved in osteoblast differentiation Runx2 and osterix, but changes in expression of alkaline phosphatase and osteocalcin mRNA mirrored nodule formation. ENC1 is a member of the BTB-Kelch family of proteins. Some members of this family have recently been found to act as substrate adaptors for the E3 ubiquitin ligase, binding to the cullin 3 component of the complex. These adaptor proteins function to bring a substrate protein within the vicinity of the E2 ubiquitin-conjugating enzyme, thus targeting it for ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. The ability of ENC1 to interact with cullin 3 was investigated as a possible mechanism by which it may affect a role in osteoblast differentiation. Full length ENC1 showed robust binding to cullin 3 and weak binding was seen between the N-terminally truncated 57kD isoform and cullin 3. ENC1, therefore, may act as a substrate adaptor protein for the cullin 3 based E3 ubiquitin ligase. These data present ENC1 as a novel candidate protein involved in osteoblast differentiation, and suggest the possible involvement of this protein in proteasomal degradation of a substrate involved in osteoblast differentiation. The ENC1 isoforms and the associated functional pathways thus are possible future therapeutic targets to treat bone loss and enhance or accelerate fracture healing.

A la suite d’un criblage in silico nous avons identifié un nouveau gène codant pour une protéine à domaine BTB-POZ, XBTBD6.<p>Nous avons déterminé que la protéine XBTBD6 est une protéine cytoplasmique. Dans les cellules Hela, CHO, U2OS et COS7 la protéine XBTBD6 est localisée dans des corpuscules cytoplasmiques, localisation similaire à celle des protéines XBTBD3, HBTBD1 et HBTBD2. Nous avons observé que la partie N-terminale de la protéine, contenant le domaine BTB-POZ, est localisée dans la cellule comme la protéine entière ;par contre la partie C-terminale est exclusivement nucléaire. De plus, nous avons observé que XBTBD6 est localisée de façon diffuse dans le cytoplasme des cellules Neuro2A, 9L et 518A2e. Nous avons montré que la protéine XBTBD6 homodimérise et hétérodimérise avec XBTBD3 et XBTBD2 et qu’elle interagit avec l’ubiquitine ligase E3 XCullin 3. L’ensemble de ces interactions nécessite la présence du domaine BTB-POZ. Ces données montrent que les protéines BTBD6, BTBD3, BTBD1 et BTBD2 possèdent des propriétés communes indiquant qu’elles appartiennent à un sous groupe de la famille des protéines à domaine BTB-POZ.<p>Le profil d’expression a été analysé par la technique de protection à la RNAse et par hybridation in situ. Les résultats montrent que ce gène est fortement exprimé dans le système nerveux adulte et embryonnaire. Des expériences de surexpression par micro-injection d’ARNm ont permis de placer le gène XBTBD6 dans la cascade d’activation des gènes proneuraux en aval de XNgnr-1, XNeuroD, Xath3 et Xebf3. Ces résultats montrent que XBTBD6 est un marqueur neuronal chez le xénope. <p>Au cours de l’étude de la fonction du gène XBTBD6, nous avons montré que la surexpression et la perte de fonction de ce gène dans l’embryon de xénope n’induit pas de variation du nombre de neurones dans la plaque neurale. Par contre nous avons observé que la surexpression du gène XBTBD6 dans des cellules Neuro2A en différentiation régule négativement la croissance des neurites.<p>Nous avons élaboré un modèle de fonctionnement biochimique hypothétique où la protéine XBTBD6 fonctionnerait comme protéine adaptatrice dans un complexe d’ubiquitination permettant l’ubiquitination d’une protéine cible. Nous avons recherché les partenaires potentiels de XBTBD6 en utilisant la technique du double hybride en levure mais sans y parvenir.<p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Study of Gordon (PHAII) and Gitelman (GS) syndromes revealed the importance of the WNK pathway and thiazide-sensitive Na-Cl Cotransporter (NCC) in the renal control of blood pressure. PHAII mutations lead to WNK accumulation resulting in the hyperphosphorylation of the downstream effector, SPAK, which overactivates NCC causing salt retention and hypertension. Mutations causing deletion of exon-9 in Cullin-3, which normally ubiquitylates WNKs for degradation, were recently discovered to cause the severest subtype of PHAII (PHA2E) with early onset salt-sensitive hypertension and hyperkalaemia. The reasons for this severity have remained elusive, however clues came from SPAK knock-out mice which recapitulate GS, the phenotypic mirror image of PHAII, typically caused by activation-inhibiting NCC phosphorylation site mutations resulting in salt-wasting and hypotension. As these mice were also discovered to have reduced vascular tone, it suggests the WNK pathway may have extra-renal roles in vascular smooth muscle function and highlights inhibition of SPAK function as a promising anti-hypertensive strategy with multiple sites of action. To address these possibilities the work aimed to phenotype: (1) heterozygous CUL3$^{WT/\Delta403-459}$ mice to investigate a possible vascular contribution to PHAII pathophysiology, (2) homozygous knock-out mice of MO25, a master regulator known to increase SPAK activity up to 100-fold independent of WNKs, and (3) homozygous SPAK$^{L502A/L502A}$ knock-ins, predicted to have disrupted SPAK binding to WNK/NCC, in order to validate SPAK signalling inhibition as a viable anti-hypertensive strategy. In mice, the CUL3$^{\Delta403-459}$ proteins are hyperflexible, hypermodified and ultimately have reduced WNK ubiquitylation. This lead to hypertension, hyperkalaemia, hyperchloraemia with compensated metabolic acidosis and growth retardation, which closely recapitulates human PHA2E. The discovery of increased vascular tone suggests an explanation for the severity of CUL3$^{\Delta}$$^{ex9}$PHAII. In mice, homozygous MO25$\alpha$ knock-out proved embryonically lethal, while homozygous MO25$\beta$ knock-out did not meaningfully alter blood pressure or electrolyte homeostasis. However, the SPAK$^{L502A}$ protein had a decreased ability to bind WNKs and cation-chloride cotransporters NCC and NKCC1/2, serving to reduce their activation. SPAK$^{L502A/L502A}$ mice showed typical features of GS with mild hypokalaemia, hypomagnesaemia, hypocalciuria and salt-wasting hypotension. The mice also presented with decreased markers of vascular tone potentially due to effects on cardiovascular and neuronal NKCC1. These results show that SPAK binding is crucial for blood pressure control and pharmacological inhibition of this binding is an attractive anti-hypertensive strategy.