Dissertação(mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, 2008. / Submitted by Caroline Silva (krol_bilhar@hotmail.com) on 2012-09-24T18:12:59Z No. of bitstreams: 1 dissertao ana priscila centeno da rosa.pdf: 832074 bytes, checksum: f714a15c9e2b09a517b32f01fb11ef36 (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-12-01T01:10:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertao ana priscila centeno da rosa.pdf: 832074 bytes, checksum: f714a15c9e2b09a517b32f01fb11ef36 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-01T01:10:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertao ana priscila centeno da rosa.pdf: 832074 bytes, checksum: f714a15c9e2b09a517b32f01fb11ef36 (MD5) Previous issue date: 2008 / Spirulina (Arthrospira) é uma microalga fotossintética, encontrada em ambientes alcalinos e é uma das mais produzidas no mundo. Sua biomassa possui alto valor nutricional e agregado. Apresenta alto teor protéico e é rica em compostos bioativos, como aminoácidos essenciais, ácidos graxos, pigmentos e vitaminas. Um sistema de produção de biomassa microalgal depende de muitos fatores, entre eles, o desenvolvimento de um meio de cultivo economicamente viável. O objetivo do presente trabalho foi estudar a influência da concentração de nutrientes no meio de cultivo para a produção da microalga Arthrospira em biorreatores tipo “raceway” e modo semicontínuo. Para os cultivos foi utilizado meio Zarrouk que teve as fontes de carbono, nitrogênio e fósforo mantidas nas concentrações padrões e os demais nutrientes (solução B) foram variados em 25% (Z-B25), 50% (Z-B50), 75% (Z-B75) e 100% (Z-100). Foram realizados ensaios com diferentes volumes do meio de cultura, 5L e 2 500 L. Nos ensaios realizados em biorreatores com volume de meio de 5 L a velocidade específica máxima de crescimento e a produtividade foram reduzidas com o consumo dos nutrientes pela microalga. Os máximos valores de velocidade específica de crescimento (0,184 d-1) e produtividade (48,03 mg.L-1.d-1) foram observados no ensaio Z-B50. Os ensaios Z-B50 e Z-B75 apresentaram velocidade específica máxima de crescimento e produtividade sem diferença significativa (p>0,15) a partir do terceiro ciclo de crescimento. No inicio do terceiro ciclo as concentrações de nitrogênio e fósforo apresentaram reduções de 21,2 e 15,7% (Z-B50) e 29,9 e 12,9% (Z-B75), respectivamente. Para cada ensaio foram realizadas análises de composição química da biomassa a cada ciclo de crescimento do cultivo. O maior teor protéico (48,8±4,1%) foi encontrado na biomassa de Arthrospira no ensaio Z-100. O ensaio ZB50 apresentou biomassa contendo 46,10±2,59% de proteína por um período de, aproximadamente, 50 d. Os cultivos em biorreatores com volume de meio de 2 500 L foram realizados em condições ambientais não controlas e foi utilizado água da Lagoa Mangueira para diluição do meio Zarrouk. A temperatura e a iluminância variaram de 16 a 42ºC e 26,3 a 105,2 klux, respectivamente. As máximas velocidades específicas de crescimento e produtividades, respectivamente, 0,276 d-1 e 148,36 mg.L-1.d-1 (ZB50) e 0,368 d-1 e 95,60 mg.L-1.d-1 (Z-100), foram encontradas no período com maior média de temperatura,. Para estes ensaios, a concentração de proteína na biomassa não apresentou diferença significativa (p>0,05). A concentração de lipídios na biomassa, ao final dos ensaios, apresentou redução em relação a concentração inicial de 22 e 52% para os ensaios Z-B50 e Z-100, respectivamente. / Spirulina (Arthrospira) is a photosynthetic microalgae found in alkaline environmental and it is one of the most produced in the world. The chemical composition of Spirulina’s biomass indicates that it has high nutritional value due its composed of a wide range of biologically active compounds, such as vitamins, pigments, fatty acids and essential amino acids. A production system of microalgae biomass depends on several factors, such as, the development of economic culture medium. The objective of this work was studied the influence of nutrients concentration on culture medium for the production Arthrospira microalgae in open raceway ponds and semicontinuous process. For the experiments, was used Zarrouk’s medium, where carbon, nitrogen and phosphorous sources were used at standard concentration and the concentration of the others nutrients (B-solution) were varied to 25% (Z-B25), 50% (Z-B50), 75% (Z-B75) and 100% (Z-100). Two experiments were performed with different culture medium volume, 5 L and 2 500 L. In an experiment performed with medium volume of 5 L, was observed a reduction on maximum specific growth rate and productivity according the nutrients consumed by microalgae. The maximum values of specific growth rate (0.184 d-1) and productivity (48.03 mg.L-1.d-1) were observed an experiment Z-B50. After the third growth cycle, the maximum specific growth rate and productivity didn’t show significant difference (p>0.15) for experiments Z-B50 and Z-B75. In the beginning of the third cycle, nitrogen and phosphorous concentrations showed a reduction of 21.1 and 15.7% for Z-B50 medium, 29.9 and 12.9% for Z-B75, respectively. For each cycle growth, analyses of chemical composition were performed from the biomass of each experiment. The highest protein content (48.8±4.1%) was found out in the Arthrospira biomass at Z-100 test. In the essay Z-B50, the biomass protein content was 46.10±2.59% for a period of 50 days, approximately. The process on bioreactor that used 2 500 L of medium volume, was carried out in environmental conditions and was utilized Mangueira Lagoon water for dilution Zarrouk’s medium. The temperature and illumination were varied between 16 to 42ºC and 26.3 to 105.2 klux, respectively. The maximum specific growth rate and productivity were, 0.276 d-1 and 148.36 mg.L-1.d-1 (ZB50) and 0.368 d-1 and 95.60 mg.L-1.d-1 (Z-100), respectively, found out in a period that presented the highest average temperature. For these experiments, the protein concentration of biomass did not show significant difference (p>0.05), already, the lipid concentration showed a reduction when compared an initial concentration of 22 and 52% for Z-B50 and Z-100 experiments, respectively.

Microalgae, photosynthetic microorganisms, are rich in lipids, polyunsaturated fatty acids, carbohydrates, proteins, vitamins, as well as carotenoids, which are antioxidants that may protect human body from various diseases including obesity, cardiovascular disease, vision-related diseases such as macular degeneration and certain types of cancer. These natural pigments have applications in the pharmaceutical (nutraceutical), food (coloring, functional food, and supplements), and cosmetics industries (e.g. sunscreen), as well as in aquaculture (animal feed). The Dunaliella salina microalga can synthesize 10% of dry weight in &#946;-carotene (orange pigment, pro-vitamin A activity) under high light intensity and nitrogen and phosphorus limitation, among other stress conditions. The first chapter of this thesis presents a review focused on microalgae carotenoids: culture systems, mode of operation, and applications. In this bibliographic survey, the advantages of microalgae cultivation in relation to traditional sources (higher plants) were discussed, as well as a discussion of the main cultivation systems and their importance in cell growth. This review presented a critical analysis of the different operational regimes like batch, fed-batch, semi-continuous and continuous. Relevant information on the most important world producers of microalgae carotenoids were presented. Chapter II presents the development of a modified method of dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) for rapid extraction of &#946;-carotene from Dunaliella salina cultivated in tubular photobioreactor, with subsequent development of a rapid chromatographic screening method using a C4 column for separation of geometric isomer of &#946;-carotene. The use of benzene as extraction solvent and water with 50% acetone as dispersant provided the best condition for the extraction of this carotenoid. In HPLC (High Performance Liquid Chromatography), employing mobile phase composed of methanol and water (95:5, v/v), it was possible to detect/quantify &#946;-carotene at 14 min (retention time). Besides the short analysis time (<20 min), by the miniaturized extraction (< 10 mL organic waste) this method abide by green chemistry analytical principles. It is known that nitrogen, phosphorus, as well as carbon and vitamins are vital elements for the growth of microalgae, also determining the biochemical composition of biomass. In this sense, Chapter III presents the study of the influence of different amounts of sodium nitrate (1N = 75 mg L-1; 1.5N = 112.5 mg L-1, and 3N = 225 mg L-1) and phosphate monobasic dehydrate (1P = 5.65 mg L-1, 1.5P = 8.47 mg L-1, and 3P = 16.95 mg L-1) in seawater-based f/2 medium on the growth of Dunaliella salina and &#946;-carotene biosynthesis, by continuous process with different replenishment proportions (R = 20% and 80%). Best results of cell productivity were obtained by semicontinuous process (mean values of Px up to 6.7 x 104 cells mL-1 d-1 with medium 1N:1P; R =20%) in comparison with batch process cultivation. Maximum cell density (Xm) obtained in this work was not dependent of R, but the best results were obtained when using medium 1.5N:1.5P (mean values up to 5.6 x 105 cells mL-1 with R =80%) instead of 1N:1P. The content of &#946;-carotene in the cells, in general, was higher in cells grown in medium 1N:1P (mean yield values up to 57.5 mg g-1 with R =80%) in comparison with medium 1.5N:1.5P. The cultivation of D. salina with media 3N:3P led to a long lag phase, followed by decrease in cell density and cell lysis. The use of a tubular photobioreactor contributed to successfully cultivate this microalga without contamination by protozoa. The cultivation of Dunaliella salina in tubular photobioreactor with the use of 12:12 photoperiod was appropriate, as well as to induce carotenogenesis, in the second stage, by increasing the light intensity and absence of pH control / As microalgas, micro-organismos fotossintetizantes, são ricas em lipídios, ácidos graxos poli-insaturados, carboidratos, proteínas, vitaminas, além de carotenoides que são antioxidantes com potencial de proteger o organismo humano de várias doenças incluindo a obesidade, doenças cardiovasculares, doenças relacionadas à visão como a degeneração macular e certos tipos de câncer, entre outras. Esses pigmentos naturais têm aplicações em indústrias farmacêuticas (nutracêuticos), alimentícias (colorantes, alimentos funcionais e suplementos) e de cosméticos (exemplo: filtro solar) e na aquacultura (ração animal). A microalga Dunaliella salina é capaz de sintetizar, sob alta intensidade luminosa e limitação de nutrientes como fontes de fósforo e nitrogênio, dentre outras condições de estresse, 10 % do peso seco em &#946;-caroteno (pigmento laranja com atividade pró-vitamina A). Assim, neste trabalho, numa primeira etapa, foi feita uma revisão da literatura abordando a produção de carotenoides por microalgas, bem como sua aplicação. Nesse levantamento bibliográfico abordou-se, dentre outros assuntos, as vantagens do cultivo de microalgas em relação as fontes tradicionais (plantas superiores), assim como uma discussão dos diferentes sistemas de cultivos e sua importância no crescimento celular. Esse review apresentou uma análise crítica dos principais regimes operacionais como batch, fed-batch, semicontínuo e contínuo. Apresentou-se também informações relevantes sobre os mais importantes produtores mundiais de carotenoides de microalgas. Numa segunda etapa, foi desenvolvido um método modificado de microextração líquido-líquido dispersivo modificado (DLLME) para a rápida extração de &#946;-caroteno de Dunaliella salina cultivada em fotobiorreatores tubulares, com subsequente desenvolvimento de método cromatográfico em uma coluna C4 para a separação do isômero geométrico de &#946;-caroteno. A extração ótima de &#946;-caroteno foi obtida com benzeno como solvente extrator e água com 50% de acetona como dispersante. Empregando uma fase móvel composta por metanol e água (95:5, v/v) em HPLC, foi possível a detecção/quantificação de &#946;-caroteno com 14 minutos de tempo de retenção. Além dos tempos curtos de análises (<20 min), pela extração em volume reduzido (< 10 mL resíduos orgânicos) este método obedece aos princípios da química verde. Sabe-se que nitrogênio, fósforo, assim como carbono e vitaminas são elementos vitais para o crescimento das microalgas e também exercem influência na composição bioquímica da biomassa. Assim, na terceira etapa deste trabalho, estudou-se a influência das quantidades de nitrato de sódio (75 mg L-1, denominado 1N; 112,5 mg L-1, denominado 1,5N; 225 mg L-1, denominado 3N) e de fosfato monobásico dihidratado (5,65 mg L-1, denominado 1P; 8,47 mg L-1, denominado 1,5P; 16,95 mg L-1, denominado 3P) em meio f/2, que tem como base a água do mar, no crescimento e na síntese de &#946;-caroteno da Dunaliella salina por processo semicontínuo, com uso de frações de corte (R) de 20% e 80%. Foram obtidas produtividades celulares mais elevadas em processos semicontínuos do que em processo descontínuo, com produtividades médias de até 6,7 x 104 células mL-1 d-1 (meio 1N:1P; R =20%). A máxima concentração celular (Xm) obtida neste trabalho não foi dependente de R. Os melhores resultados de Xm foram obtidos quando se usou meio 1,5N:1,5P em vez de meio, com 1N:1P, com valores médios de até 5,6 x 105 células m L-1 (R =80%). O conteúdo de &#946;-caroteno nas células, de maneira geral, foi maior nas células cultivadas em meio 1N:1P do que no meio 1,5N:1,5P, com valores até 57,5 mg g-1 (R =80%). O cultivo de D. salina com o meio 3N:3P levou a uma longa fase lag, seguida por uma diminuição na concentração celular e sua lise. O cultivo de células em um fotobiorreator tubular contribuiu para um crescimento celular sem contaminação por protozoários. O cultivo de Dunaliella salina em fotobiorreator tubular com o uso de fotoperíodo 12:12 foi apropriado, assim como induzir a carotenogênese, no segundo estágio, por meio do aumento da intensidade luminosa e ausência de controle de pH.