Le développement de méthodes alternatives à la culture in vivo pour l’évaluation de la toxicité des molécules chimiques s’est accéléré ces dernières années, l’objectif étant de limiter l’utilisation d’animaux. Préconisés par l’OCDE (Organisation de coopération et de développement économiques), ces modèles alternatifs visent à mimer les conditions physiologiques en employant des systèmes in vitro ou in silico. Parmi les différents systèmes développés, les biopuces microfluidiques ont prouvé leur contribution à l’amélioration des fonctions cellulaires, ce qui permet des études toxicologiques pertinentes. Les travaux de ce doctorat sont basés sur l’emploi de ces biopuces pour cultiver des hépatocytes (cellules du foie) et portent sur la mise au point d’une méthode d’analyse d’images issues de ces cultures sous microscope au cours du temps. L’acquisition d’images tout au long de l’expérience permet de suivre, après traitement, l’évolution et le comportement des cellules au contact de molécules chimiques et d’évaluer les réponses toxicologiques. Les premiers résultats de ces travaux ont permis l’amélioration du procédé de culture microfluidique adaptée au matériel d’acquisition d’images, la sélection de sondes fluorescentes, et le choix d’un algorithme de traitement des images sur CellProfiler. Cela nous a permis de quantifier et caractériser certaines fonctions biologiques au sein de la biopuce comme l’activité mitochondriale. Le potentiel de cet outil pour évaluer la toxicité de molécule a été testé grâce à l’emploi d’un toxique connu : la staurosporine. Les résultats obtenus ont révélé l’impact de la mise en culture en dynamique sur le comportement des hépatocytes, et la toxicité de la staurosporine visible en biopuce. / The development of alternative methods of in vivo cultures for the toxicological evaluation of chemical molecules has accelerated this last years, in order to limit the use of animals. Recommended by the OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development), these alternative models are designed to mimic the physiological conditions using in vitro or in silico systems. Among the developed systems, microfluidic biochips have proven their contribution to the improvement of cellular functions, which allows relevant toxicological studies. This PhD thesis is based on the use of these biochips for hepatocytes culture and focus on the development of an analysis method for study these cultures under microscope over time using imaging. Image acquisition throughout the experiment enables to analyze, after image processing, the evolution and the behavior of cells in contact with chemical molecules and to evaluate toxicological responses. The first results of this work led to the optimization of the microfluidic cultures under the microscope used to get the image sequences, the selection of fluorescent probes and the development of an image processing system with CellProfiler. These works allowed the quantification and the characterization of some biological functions within the biochip such as the mitochondrial activity. Staurosporine, a well-known toxic, has been used to test the potential of this tool to evaluate the toxicity of molecules. The results showed the impact of dynamic culture on the hepatocytes behavior, and the staurosporine toxicity, in biochip cultures.

L'organisme humain présente de nombreuses constantes de régénération tissulaires et c'est cette caractéristique essentielle qui maintient l'équilibre physiologique. Toutefois, l'existence de lésions importantes provoquée par un déséquilibre interne ou externe peut empêcher l'organisme de s'auto-régénerer. Dans ce cas, l'application des biomatériaux développés pour des applications biomédicales peuvent améliorer le processus de guérison. Pour les applications en tissus durs, les biomatériaux doivent posséder des propriétés similaires aux matrices naturelles tant sur le plan biologique que physico-mécanique. Dans les applications en bioingénierie osseuse, les composites à base de collagène (Col) et d'hydroxiapatite (HA) sont devenus tellement performant qu'ils peuvent être classifiés comme des matériaux biomimétiques. Cette thèse propose la production d'une matrice 3-D poreuse à base d'HA et de Col (50:50wt%). Ce composite réticulé par le glutaraldéhyde a été caractérisé par des différentes techniques et servira de support pour la culture cellulaire. Des cellules estromales ostéoprogénitrices ont été cultivées dans un environnement statique et dynamique (deux vitesse de flux) et leurs capacités de colonisation ainsi que leurs comportements d'adhésion, de prolifération, de différentiation seront observés. A travers les résultats de diffraction de rayons X et de spectroscopie infrarouge, il est possible d'affirmer la présence dans la matrice collagène d'une phase minérale peu cristalline constituée par de l'hydroxiapatite carbonatée du type-B déficiente en calcium. La viabilité cellulaire a été fortement influencée par les systèmes de culture au cours des 21 jours. Les résultats du système dynamique en haute vitesse montrent une excellente capacité du composite à supporter les processus cellulaires. Les cellules sont capables d'adhérer, de proliférer et de coloniser la matrice tridimensionnelle.

L’organisme humain présente de nombreuses constantes de régénération tissulaires et c’est cette caractéristique essentielle qui maintient l’équilibre physiologique. Toutefois, l’existence de lésions importantes provoquée par un déséquilibre interne ou externe peut empêcher l’organisme de s’auto-régénerer. Dans ce cas, l’application des biomatériaux développés pour des applications biomédicales peuvent améliorer le processus de guérison. Pour les applications en tissus durs, les biomatériaux doivent posséder des propriétés similaires aux matrices naturelles tant sur le plan biologique que physico-mécanique. Dans les applications en bioingénierie osseuse, les composites à base de collagène (Col) et d’hydroxiapatite (HA) sont devenus tellement performant qu’ils peuvent être classifiés comme des matériaux biomimétiques. Cette thèse propose la production d’une matrice 3-D poreuse à base d’HA et de Col (50:50wt%). Ce composite réticulé par le glutaraldéhyde a été caractérisé par des différentes techniques et servira de support pour la culture cellulaire. Des cellules estromales ostéoprogénitrices ont été cultivées dans un environnement statique et dynamique (deux vitesse de flux) et leurs capacités de colonisation ainsi que leurs comportements d’adhésion, de prolifération, de différentiation seront observés. A travers les résultats de diffraction de rayons X et de spectroscopie infrarouge, il est possible d’affirmer la présence dans la matrice collagène d’une phase minérale peu cristalline constituée par de l’hydroxiapatite carbonatée du type-B déficiente en calcium. La viabilité cellulaire a été fortement influencée par les systèmes de culture au cours des 21 jours. Les résultats du système dynamique en haute vitesse montrent une excellente capacité du composite à supporter les processus cellulaires. Les cellules sont capables d’adhérer, de proliférer et de coloniser la matrice tridimensionnelle. / The progress in Tissue Engineering area allows the development of biomaterials that mimic the properties of natural tissues. For biomedical applications in mineralized tissues, composites based on hydroxyapatite (HA) and collagen (Col) have presented good results when implanted in vivo. The aim of this work was to produce a 3-D matrix and to observe the cell behaviour when stromal cells are cultured in contact with HA-Col scaffold under static and dynamic conditions. For in vitro biological evaluation, osteoprogenitor human cells (Stro+1A cells) were grown and their colonization capacity and adhesion, proliferation and differentiation behaviour were quantified. Two perfusion flow rates (0,03ml/min and 0,3ml/min) were proposed for dynamic culture. The HA-Col composite was prepared by reorganization of Col fibrils simultaneously with HA crystal nucleation and precipitation from calcium and phosphate rich solutions. Afterwards, the composites were crosslinked and sterilized by gamma radiation. Stro+1A cells were inoculated (5x105 cells/sample) into the scaffolds and cultured over 21 days in a humid incubator at 37°C and 5% CO2. Infrared spectroscopy and X-ray diffraction results suggested a calcium-deficient hydroxyapatite as mineral phase. About cell culture, the cell number increased under higher flow rate dynamic culture. By scanning electron microscopy and histological sections, we observed cells adhered and spread inside colonized scaffolds.

Le développement de méthodes alternatives à la culture in vivo pour l'évaluation de la toxicité des molécules chimiques s'est accéléré ces dernières années, l'objectif étant de limiter l'utilisation d'animaux. Préconisés par l'OCDE (Organisation de coopération et de développement économiques), ces modèles alternatifs visent à mimer les conditions physiologiques en employant des systèmes in vitro ou in silico. Parmi les différents systèmes développés, les biopuces microfluidiques ont prouvé leur contribution à l'amélioration des fonctions cellulaires, ce qui permet des études toxicologiques pertinentes. Les travaux de ce doctorat sont basés sur l'emploi de ces biopuces pour cultiver des hépatocytes (cellules du foie) et portent sur la mise au point d'une méthode d'analyse d'images issues de ces cultures sous microscope au cours du temps. L'acquisition d'images tout au long de l'expérience permet de suivre, après traitement, l'évolution et le comportement des cellules au contact de molécules chimiques et d'évaluer les réponses toxicologiques. Les premiers résultats de ces travaux ont permis l'amélioration du procédé de culture microfluidique adaptée au matériel d'acquisition d'images, la sélection de sondes fluorescentes, et le choix d'un algorithme de traitement des images sur CellProfiler. Cela nous a permis de quantifier et caractériser certaines fonctions biologiques au sein de la biopuce comme l'activité mitochondriale. Le potentiel de cet outil pour évaluer la toxicité de molécule a été testé grâce à l'emploi d'un toxique connu : la staurosporine. Les résultats obtenus ont révélé l'impact de la mise en culture en dynamique sur le comportement des hépatocytes, et la toxicité de la staurosporine visible en biopuce.