Les brûlures cutanées graves dont les lésions profondes et étendues des tissus ne permettent pas d’envisager un traitement classique par autogreffes, bénéficient aujourd’hui de substituts épidermiques autologues pour leur recouvrement. En effet l’ingénierie tissulaire permet l’obtention d’épiderme de culture autologue (CEA) par l’amplification in vitro de kératinocytes à partir d’une petite biopsie de peau saine. Si ces CEAs ont permis la survie de nombreux patients depuis les années 1980, ils n’en restent pas moins largement perfectibles du point de vue de l’esthétique et de la fonctionnalité de l’épiderme et de la jonction dermo-épidermique régénérés mais aussi en termes de coûts et de prévention des zoonoses.Ainsi, ce travail de thèse s’inscrit dans le cadre d’une recherche translationnelle et porte sur l’élaboration d’un épiderme de culture par ingénierie tissulaire en vue d’une application clinique chez les grands brûlés, afin de favoriser la cicatrisation et la régénération épidermique. Ce travail porte également sur l’évaluation non clinique de notre substitut épidermique sur un modèle animal de brûlure cutanée.Après avoir développé un nouveau substitut épidermique sur fibrine de plasma humain (hPBES : human Plasma-Based Epidermal Substitute), nous avons procédé à l’évaluation détaillée de ses caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles en comparaison au substitut épidermique de référence Epicel® (Genzyme, US). Nous avons montré des propriétés plus intéressantes en termes de clonogénicité et de caractère souche, de prévention de la différenciation, de prolifération, de potentiel de migration, et de conservation des protéines de la membrane basale avec notre produit par rapport à Epicel®.L’apport de la matrice de fibrine de plasma sur la culture des kératinocytes en comparaison à une matrice de fibrine issue de fibrinogène purifié et à une culture sans matrice a été étudié notamment sous l’angle des facteurs libérés par les matrices. Nous avons observé une amélioration des propriétés des substituts épidermiques par la fibrine : diminution de la différenciation terminale, augmentation du potentiel migratoire et sécrétion de facteurs pro-cicatrisants (GM-CSF et PDGF-BB). En outre, la fibrine de plasma améliore spécifiquement la morphogénèse épidermique, la prolifération kératinocytaire et la clonogénicité.Le procédé de culture de ce nouveau substitut a été adapté aux exigences réglementaires sans altération du potentiel régénératif: remplacement des cellules nourricières murines par des fibroblastes dermiques humains, adaptation du milieu de culture et sécurisation du plasma par traitement à l’amotosalen.Toutes les étapes d’un modèle de brûlure chez le rat nude reproduisant la technique chirurgicale employée pour la greffe de CEA ont été mises au point, mais un rejet du greffon épidermique n’a pas permis l’évaluation d’hPBES sur ce modèle. Nous avons donc évalué le substitut épidermique développé hPBES chez la souris NOD-SCID après greffe au fascia et mis en évidence une bonne prise de greffe épidermique permettant la régénération d’un épiderme humain aux caractéristiques proches d’une peau saine avec une réorganisation de la jonction dermo-épidermique des 2 semaines après greffe. / The deep and large injuries caused by massive burns prevent the use of split-thickness skin autografts. Today, autologous epidermal substitutes constitute an alternative treatment for skin regeneration. In fact tissue engineering allows the production of Cultured Epithelial Autografts (CEA) by in vitro keratinocyte amplification from a small healthy skin biopsy. The clinical use of CEA since the 1980’s has allowed an increase in the survival rate of burnt patients. However, CEAs present numerous drawbacks, among them the high fragility of keratinocyte sheets, and the immaturity of the dermal-epidermal junction leading to heavy cosmetic and functional sequelae.This thesis focuses on the bioengineering of epidermal substitute for clinical burn treatment to enhance wound healing and skin regeneration, from a translational research point of view. This work also includes the development of an animal model of third degree burn for the evaluation of epidermal substitute.We first developed a new epidermal substitute cultured on a fibrin matrix from human plasma (hPBES: human Plasma-Based Epidermal Substitute). Then we characterized this new substitute with phenotypical and functional analyses, using as a reference the epidermal substitute Epicel® (Genzyme, US). We observed properties more favorable with hPBES than with Epicel® in terms of clonogenicity, stemness, differentiation level, proliferation, migration potential and basement membrane protein conservation.The influence of the plasma-based fibrin matrix on keratinocytes was studied in comparison with a culture on a fibrin from purified fibrinogen, and with a culture with no matrix. For this study we focused our analysis on the role of the released factors from fibrin matrices during epidermal substitute culture. Both fibrin matrices improved epidermal substitute properties: reduction of terminal differentiation, enhancement of migration potential, secretion of wound healing enhancing factors. Besides, plasma-based fibrin specifically promote epidermal morphogenesis, keratinocyte proliferation and clonogenicity.The culture process was adapted to European regulation requirements without diminishing its regenerative potential: substitution of murine feeder cells by human dermal fibroblasts, adaptation of culture medium and plasma viral inactivation using amotosalen treatment.A burn model including all the surgical steps used in clinics for CEA grating was developed on nude rats. However the evaluation of hPBES on this model could not be achieved due to graft rejection. Therefore we evaluated epidermal regeneration after hPBES graft on acute wounds on NOD-SCID mice. We showed a good graft rate, with the regeneration of a human epidermis close to healthy epidermis with a well-organized dermal-epidermal junction two weeks after hPBES grafting.

Malgré l’évolution des outils de bio-ingénierie tissulaire et la sophistication des recherches visant à développer de nouveaux substituts cutanés, la prise en charge clinique des brûlures sévères a relativement peu évolué depuis plus de 30 ans. Si la survie est quasiment garantie par l’utilisation de cultures d’épidermes autologues (CEA), le traitement des grands brûlés n’en reste pas moins traumatisant, avec l’émergence de séquelles physiques (cicatrices hypertrophiques, dyschromies, fragilité cutanée), pathophysiologiques (désordres métaboliques et immunitaires), et neuropsychologiques (neuropathies, douleurs chroniques, syndrome de stress post-traumatique). Depuis leur découverte dans les années 1960, les Cellules Stromales Mésenchymateuses (CSM) ont suscité un intérêt grandissant dans le domaine de la thérapie cellulaire, en raison de leurs propriétés trophiques et immunomodulatoires. La découverte de leur haute plasticité face à divers stimuli environnementaux a plus récemment ouvert le champ de nouvelles stratégies de thérapie ciblée appelées « préconditionnement ». Ainsi, cette thèse a pour objet l’évaluation d’une stratégie de préconditionnement de CSM, afin d’en potentialiser l’action thérapeutique, dans le cadre du traitement de brûlures par CEA. Ce travail de thèse a été partagé en trois unités expérimentales. Tout d’abord la stratégie de préconditionnement a été mise au point sur des modèles de cicatrisation in vitro, permettant ainsi de souligner le rôle intéressant de l’interleukine-1β (IL-1β) et de la substance P (SP). Ensuite, l’efficacité et les mécanismes d’action de ces facteurs de préconditionnement ont été évalués in vitro, puis in vivo sur un modèle de plaie excisionnelle, en utilisant les CSM ou leurs produits de sécrétion. Il a ainsi pu être démontré que l’IL-1β améliorait l’efficacité des CSM en promouvant leur activité anti-inflammatoire, pro-migratoire et de remodelage. Il a également été montré que cet effet était en partie lié à un mécanisme impliquant la voie du TGF-β1. Enfin, la plus-value de cette stratégie thérapeutique a fait l’objet d’une étude in vivo sur un modèle de brûlure profonde mimant la prise en charge du patient sévèrement brûlé. Malgré divers problèmes techniques limitant la prise de greffe de CEA dans ce modèle, l’effet anti-inflammatoire et pro-angiogénique des CSM a pu être confirmé. Ces résultats semblent donc montrer l’intérêt d’une thérapie par CSM préconditionnées. Des études précliniques complémentaires sont maintenant requises pour vérifier la plus-value d’une telle thérapie dans le contexte de la brûlure cutanée. / Since the 1980’s, little progress has been made in the management of major burns, in spite of several research advances in the field of skin tissue engineering and regenerative medicine. Developed in 1975, Cultured Epithelial Autografts (CEA) are the last-in-date significant breakthrough, allowing patient survival in most critical cases. However, patients still have to cope with debilitating sequelae including hypertrophic scars, skin fragility, immunometabolic dysfunctions, chronic pain and post-traumatic stress disorder. Mesenchymal Stromal Cells (MSC) have raised an increasing interest during the past 50 years due to their trophic and immunomodulatory properties. Recent findings about their high plasticity to external stimuli have fostered the development of new targeted therapies known as “preconditioning strategies”. This PhD work thus aimed to assess a MSC preconditioning strategy for the treatment of major burns using CEA. The present work was divided into three main experimental parts. First, in vitro experiments were developed in order to set up the preconditioning strategy, and revealed the interesting role of both interleukin-1β (IL-1β) and substance P (SP). Then, both effectiveness and mechanism of action of these preconditioning modalities were assessed in vitro and in vivo, either using MSC or their secretory products. It was thus shown that IL-1β could potentiate MSC effectiveness through the promotion of pro-migratory, anti-inflammatory and pro-remodeling activities. This effect was shown to be partly mediated by the TGF-β1 signaling pathway. At last, this preconditioning strategy was evaluated in a third degree burn rat model mimicking the surgical treatment applied to severe burn patients. Despite technical hurdles limiting CEA engraftment, anti-inflammatory and pro-angiogenic properties of MSCs were confirmed in this model. These preliminary results underline the potential of a preconditioned MSC therapy in wound healing. Additional preclinical studies are now required to corroborate the benefit of such a therapy in major burns.