A busca por melhores resultados nas biotecnologias reprodutivas leva a um estudo dos mecanismos fisiológicos básicos dos gametas e embriões em estágios iniciais. Entender como funciona o desenvolvimento destes, quais os nutrientes que eles precisam para se desenvolver in vitro e quais as condições ambientais necessárias permitem maiores taxas de sucesso. Tendo em vista a heterogeneidade dos complexos cumulus-oócito (COC) bovinos recuperados de ovários obtidos em frigorífico para a maturação in vitro e a relação entre oócito e células do cumulus nos resultados da produção in vitro de embriões, esse trabalho visa a identificação de fatores moleculares que possam explicar as melhores taxas de blastocistos obtidas por COCs com mais de três camadas de células do cumulus compactas e ooplasma homogêneo (COCI) quando comparados com COCs com menos de duas camadas de células do cumulus, com parte da zona pelúcida exposta e ooplasma homogêneo ou heterogêneo (COCIII). Para isso, COCI e III foram maturados in vitro separadamente, foram vortexados para retirada das células do cumulus e os oócitos foram submetidos a extração de RNA. O RNA foi amplificado em aRNA, marcado com biotina, fragmentado e hibridizado em microarray. Os arrays foram escaneados e os dados gerados analisados pelo métodos Significance Analysis of Microarrays e Rank Products em busca de genes diferencialmente expressos (DEG). A análise funcional in silico foi realizada com a ferramenta Ingenuity Pathway Analysis. Os resultados mostraram que o perfil de expressão dos oócitos de COCIII é diferente do perfil dos oócitos de COCI, como pode ser observado pelos 446 DEGs identificados, sendo 24 com expressão aumentada em oócitos de COCIII. Os genes com expressão alterada estão envolvidos em processos básicos da célula, como reassumição da meiose, metabolismo do oócito e maturação molecular, o que corrobora a ideia de que uma grande quantidade de células do cumulus interagindo com o oócito é crucial para a competência de desenvolvimento. / The researches for better results in reproductive biotechnologies have leading to studies of the basic physiological mechanisms of gametes and embryos in the early stages of developmental. Understand about their development, which nutrients they need and what environmental conditions are necessary to allow higher success rates. Because of the cumulus-oocyte complexes (COC) heterogeneous recovered from bovine ovaries obtained from an abattoir used for in vitro maturation and the relationship between oocyte and cumulus cells in the in vitro production of embryos, this study aims to identify molecular factors which might explain the improved rates of blastocyst obtained by COCs with more than three compact layers of cumulus cells and homogeneous ooplasm (COCI) compared with COC with less than two layers of cumulus cells, with part of the zona pellucida exposed and homogeneous or heterogeneous ooplasm (COCIII). For this, COCI and III were matured in vitro separately, their cumulus cells were removed and oocytes were subjected to RNA extraction. The RNA was amplified in aRNA, biotin labeled, fragmented and hybridized on microarray. The arrays were scanned and the data generated analyzed by the Significance Analysis of Microarrays and Rank Products methods in search of differentially expressed genes (DEG). In silico functional analysis were performed using Ingenuity Pathway Analysis. The results showed that the expression profile of COCIII oocytes is different from the profile of COCI oocytes. 446 DEGs were identified of which 24 presented increased expression in COCIII oocytes. Genes with altered expression are, in general, involved in the basic processes of the cell, as reassume of meiosis, metabolism of the oocyte and molecular maturation, which confirms the idea that a large amount of cumulus cells interacting with the oocyte is crucial for the development of competence.

A busca por melhores resultados nas biotecnologias reprodutivas leva a um estudo dos mecanismos fisiológicos básicos dos gametas e embriões em estágios iniciais. Entender como funciona o desenvolvimento destes, quais os nutrientes que eles precisam para se desenvolver in vitro e quais as condições ambientais necessárias permitem maiores taxas de sucesso. Tendo em vista a heterogeneidade dos complexos cumulus-oócito (COC) bovinos recuperados de ovários obtidos em frigorífico para a maturação in vitro e a relação entre oócito e células do cumulus nos resultados da produção in vitro de embriões, esse trabalho visa a identificação de fatores moleculares que possam explicar as melhores taxas de blastocistos obtidas por COCs com mais de três camadas de células do cumulus compactas e ooplasma homogêneo (COCI) quando comparados com COCs com menos de duas camadas de células do cumulus, com parte da zona pelúcida exposta e ooplasma homogêneo ou heterogêneo (COCIII). Para isso, COCI e III foram maturados in vitro separadamente, foram vortexados para retirada das células do cumulus e os oócitos foram submetidos a extração de RNA. O RNA foi amplificado em aRNA, marcado com biotina, fragmentado e hibridizado em microarray. Os arrays foram escaneados e os dados gerados analisados pelo métodos Significance Analysis of Microarrays e Rank Products em busca de genes diferencialmente expressos (DEG). A análise funcional in silico foi realizada com a ferramenta Ingenuity Pathway Analysis. Os resultados mostraram que o perfil de expressão dos oócitos de COCIII é diferente do perfil dos oócitos de COCI, como pode ser observado pelos 446 DEGs identificados, sendo 24 com expressão aumentada em oócitos de COCIII. Os genes com expressão alterada estão envolvidos em processos básicos da célula, como reassumição da meiose, metabolismo do oócito e maturação molecular, o que corrobora a ideia de que uma grande quantidade de células do cumulus interagindo com o oócito é crucial para a competência de desenvolvimento. / The researches for better results in reproductive biotechnologies have leading to studies of the basic physiological mechanisms of gametes and embryos in the early stages of developmental. Understand about their development, which nutrients they need and what environmental conditions are necessary to allow higher success rates. Because of the cumulus-oocyte complexes (COC) heterogeneous recovered from bovine ovaries obtained from an abattoir used for in vitro maturation and the relationship between oocyte and cumulus cells in the in vitro production of embryos, this study aims to identify molecular factors which might explain the improved rates of blastocyst obtained by COCs with more than three compact layers of cumulus cells and homogeneous ooplasm (COCI) compared with COC with less than two layers of cumulus cells, with part of the zona pellucida exposed and homogeneous or heterogeneous ooplasm (COCIII). For this, COCI and III were matured in vitro separately, their cumulus cells were removed and oocytes were subjected to RNA extraction. The RNA was amplified in aRNA, biotin labeled, fragmented and hybridized on microarray. The arrays were scanned and the data generated analyzed by the Significance Analysis of Microarrays and Rank Products methods in search of differentially expressed genes (DEG). In silico functional analysis were performed using Ingenuity Pathway Analysis. The results showed that the expression profile of COCIII oocytes is different from the profile of COCI oocytes. 446 DEGs were identified of which 24 presented increased expression in COCIII oocytes. Genes with altered expression are, in general, involved in the basic processes of the cell, as reassume of meiosis, metabolism of the oocyte and molecular maturation, which confirms the idea that a large amount of cumulus cells interacting with the oocyte is crucial for the development of competence.

Chez la vache Prim’Holstein, un QTL de fertilité a été localisé sur le chromosome 3, et deux haplotypes ont été déterminés : « Fertil+ » et « Fertil- ». Les « Fertil- » ont un plus fort taux d’échec de gestation précoce. Le 1er objectif de cette thèse était de déterminer si un dysfonctionnement des complexes ovocyte-cumulus (COC) pouvait expliquer l’échec précoce de gestation chez les « Fertil- ». L’analyse révèle un retard de maturation, une dérégulation de gènes appartenant aux voies des prostaglandines et des MAPK, et à la famille des Tribbles dans les CC ou l’ovocyte des « Fertil- ». Trois gènes composent la famille des Tribbles chez le bovin: TRIB1, TRIB2 et TRIB3, leur fonction est indéterminée dans le COC. Le 2nd objectif était de caractériser le patron d’expression des Tribbles et leur(s) fonction(s) au sein du COC bovin. Les Tribbles joueraient un rôle dans le métabolisme lipidique et l’inflammation au niveau folliculaire. Le métabolisme lipidique au sein du COC bovin étant peu caractérisé, le 3ème objectif était d’appréhender les profils des gènes du métabolisme des acides gras (AG) dans les CC au cours de la maturation. Ainsi, les CC expriment les gènes lipotytiques et lipogéniques. Enfin, la β-oxydation des AG est une fonction primordiale pour la maturation ovocytaire. / In Prim’Holstein cow, a fertility QTL was localized on chromosome 3 and two haplotypes were determined: « Fertil+ » and « Fertil- ». « Fertil- » have a higher early pregnancy failure rate. The 1st objective of the thesis was to define if complex oocyte-cumulus COC dysfunction could explain the early pregnancy failure in « Fertil- ». Analysis highlighted a maturation delay, a dysregulation of genes involved in prostaglandin and MAPK pathway along with one member of the Tribbles family in « Fertil- » CC or oocyte. In bovine, the Tribbles family is composed of three genes: TRIB1, TRIB2 and TRIB3, their function is unknown within the COC. The 2nd objective was to characterize the Tribbles expression pattern and their function in the bovine COC. The tribbles might play a role in lipid metabolism and in inflammation at the follicular level. Lipid metabolism within bovine COC is poorly understood, thus the third objective was to apprehend fatty acid (FA) genes pattern in CC during maturation. Thus, CC express lipolytic and lipogenic genes. Lastly, FA β oxidation is found to be important for oocyte maturation.