Na dentina, a matriz orgânica desmineralizada tem um papel protetor contra desafios erosivos subsequentes. Porém, essa camada pode ser degradada por proteases, como as metaloproteinases da matriz (MMPs) e cisteína catepsinas (CCs). Recentemente, o uso de inibidores de proteases da matriz surgiu como uma importante ferramenta preventiva contra a erosão dentinária. Entretanto, o(s) mecanismo(s) exato(s) pelo(s) qual(is) os inibidores de proteases podem prevenir a erosão dentinária, bem como os tipos de proteases mais envolvidas neste processo ainda não são completamente conhecidos. O projeto foi desenvolvido em 2 subprojetos, com os seguintes objetivos: A)Subprojeto 1:Avaliar o papel das proteases na progressão da erosão dentária; B)subprojeto 2: Testar o potencial inibitório do NaF em CCs dentinárias. Para cumprir esses objetivos, foram utilizadas dentina de terceiros molares humanos para a preparação dos espécimes. A)Subprojeto1:Blocos de dentina (4 X 4 x 2 mm) (n=119) foram obtidos de raízes. Os espécimes foram divididos em 7 grupos de acordo com o seu tratamento (E-64, inibidor especifico II de catepsinas B, clorexidina, galardina NaF, placebo) ou sem tratamento, géis foram aplicados uma única vez sobre a superfície e feito o desafio erosivo (90s, 4x por dia por 5 dias) e feita analise perfilométrica. Os espécimes foram incubadas em solução contendo colagenase de Clostridium histolyticum tipo VII por 96hrs e então feita uma segunda analise perfilometrica para se determinar a espessura da MOD. Dois espécimes foram separados para análise de microscopia eletrônica de varredura. B)Subprojeto 2: Palitos de dentina (6 mm X 2 mm X 1 mm) (n=60) foram cortados da porção médio coronária dos dentes e completamente desmineralizados por imersão em EDTA 0,5 M (pH7,4) por 30 dias e lavados em água deionizada sob constante agitação a 4ºC por 72 h. Os espécimes foram divididos em 6 grupos (E-64, NaF e controle negativo, pH 5,5 ou 7,2) e incubados em saliva artificial contendo seus respectivos inibidores por 24 h 7 dias e 21 dias; ao termino de cada período, os espécimes eram pesados para avaliar a perda de massa e analisada a presença de CTX. A)Subprojeto 1: a perda de tecido desmineralizado (m, média± SD) foi: CHX 8,4±1,7b, Gala 8,6±1,9b, IECB 9,6±1,4a, E64 9,9±1,3a, NaF 9,9±1,7a, P 10,9±2,2a, ST 11,0±1,5a. A perda de tecido mineralizado foi: CHX 15,4±2,2b, Gala 16,0±1,8b, IECB 17,6±2,4a, E64 17,6±2,0a, NaF 17,3±2,8a, P 19,1±2,1a, ST 18,9±2,4a. Os inibidores de MMP reduziu significativamente a perda de matriz orgânica e tecido mineralizado em comparação com os outros grupos (p<0,05). Não foi achada diferença significante entre a espessura da matriz orgânica desmineralizada remanescente (p=0,845). B)Subprojeto 2: Na perda de massa houve diferença significante em relação ao inibidor (F=20,047, p<0,0001) e tempo de incubação (F=222,462, p<0,0001) com significante interação entre esses critérios, nos período de menor tempo de incubação, a perda foi similar para todos os grupos testados, no período de maior tempo de incubação, o grupo contendo NaF demostrou os melhores resultados. Na analise de CTX, houve diferença significante em relação aos inibidores (F46,543, p<0,0001), pH (F=14,836, p<0,0004) e tempo de incubação (F=161,438, p<0,0001) com significante interação entre esses critérios, como ocorrido na perda de massa, não houve diferença estatística nos períodos de menor incubação. No período de maior tempo de incubação, mais uma vez o grupo NaF mostrou os melhores resultados. No valor acumulado de CTX, os grupos E64 e controle negativo tiveram os maiores valores de CTX acumulado, o grupo NaF, independente do pH mostrou redução significante em relação aos demais grupos. Após analise dos resultados dos dois subprojetos, podemos indicar que as MMPs são as proteases de maior importância na progressão da erosão dentinária, assim, sua inibição é de maior importância para a redução desta patologia. Mesmo as CCs não exercendo papel direto para a progressão da erosão, elas são efetivas na cascata da ativação de outras proteases, como as próprias MMPs. Com isso, sua inibição também pode ser importante para a redução indireta da progressão da erosão. Neste presente estudo, pudemos comprovar que o NaF tem potencial inibitório sobre as CCs dentinárias, assim, sugerindo um novo inbidor de CCs. Com os resultados deste estudo, podemos afirmar que as MMPs são as principais proteases na progressão da erosão dentinária e que o NaF tem potencial inibitório nas CCs dentinárias. / In the dentine, the demineralized organic matrix has a protector part against the following erosive challenges. Nevertheless, this layer can be degraded by proteases, like the matrix metalloproteinases (MMPS) and cystein cathepsins (CCs). Recently, the use of proteases of the matrix´s inhibitors, emerged as an important preventive tool against the dentinária erosion. However, the exact mechanisms from which the inhibitors of the proteases may prevent the dentin erosion, as much as the kinds of proteases more involved in this process are not completely known yet. Therefore, the general objective of this project was to investigate the part of the two main proteases of the matrix (MMPs and CCs) in the dental erosion. The project was developed in 2 subprojects, with the following objectives: A)Subproject 1: Evaluate the part of the proteases in the progression of the dental erosion; B)subproject 2: To test the NaF inhibitory potencial in the dentin CCs. To accomplish these objectives, human third molar dentin were used for the preparation of the specimens, obtained in the surgery and urgency clinics of FOB-USP (subproject 1) or granted by the University of Oulu (subproject 2). A) Subproject 1: Dentine blocks 4 X 4 X 2 mm) (n=119) were obtained from the roots of the obtained teeth. The specimens were divided in 7 groups according with their treatment. Gels containing inhibitors (E-64, specific cathepsin B inhibitor II, chlorhexidine, galardin NaF, placebo), or without treatment, were produced, applied only one time over the surface and made the erosive challenge (90s, 4x a day for 5 days) and made profilometric analysis. The specimens were incubated in a solution containing collagenase of Clostridium histolyticum type VII for 96 hours and then a second profilometric analysis was made to determine the thickness of the MOD. Two specimens were separated for the electronic microscopy scan analysis. B) Subproject 2: Dentine sticks (6 mm X 2 mm X 1 mm) (n=60) were cut from the medium coronary portion of the teeth and completely demineralized by immersion in EDTA 0,5 M (pH7,4) ifor 30 days and washed in deionized water under constant agitation in 4º C for 72 hours. The specimens were divided in 6 groups (divided by inhibitors: E-64, NaF and negative control, pH 5,5 or 7,2) and incubated in artificial saliva containing their respective inhibitors for 24 hours, 7 days and 21 days; by the end of each period, the specimens were weighted to evaluate the loss of mass and analised the presence of CTX. A)Subproject 1: the loss of demineralized tissue (m, média± SD) was : CHX 8,4±1,7b, Gala 8,6±1,9b, IECB 9,6±1,4a, E64 9,9±1,3a, NaF 9,9±1,7a, P 10,9±2,2a, ST 11,0±1,5a. The loss of demineralized tissue was: CHX 15,4±2,2b, Gala 16,0±1,8b, IECB 17,6±2,4a, E64 17,6±2,0a, NaF 17,3±2,8a, P 19,1±2,1a, ST 18,9±2,4a. The MMP inhibitors reduced significantly the loss of organic matrix and demineralized tissue in comparison with other groups (p<0,05). There was no significant difference found between the thickness of the remaining demineralized organic matrix.(p=0,845). B)Subproject: In the loss of mass, there was a significant difference in relation to the inhibitor (F=20,047, p<0,0001) and incubation time (F=222,462, p<0,0001) with significant interaction between these criteria, in the periods of lesser time of incubation, the loss was similar for all the tested groups, in the period of higher time of incubation, the group containing NaF demonstrated the best results. In the analysis of CTX, there was significant difference in relation the inhibitors (F46,543, p<0,0001), pH (F=14,836, p<0,0004) and time of incubation (F=161,438, p<0,0001)with significant interaction between these criteria, as occurred in the mass loss, there was no statistic difference in the period of lesser incubation. In the period of higher time of incubation, once again, the NaF group demonstrated the best results. The CTX accumulated value, the E64 groups and negative control had the greater accumulated values of CTX, the NaF group, regardlessof the pH, demonstrated significant reduction in relation to the other groups. After the analysisof the results of both subprojects, we can indicate that the MMPs are the proteases of greater importance in the progression of the dentin erosion, thus, its inhibition is of graeter importance for the reduction of this pathology. Even the CCs don´t playing the part directly for the progression of erosion, they are effective in the cascade of the activation of other proteases, like the MMPs themselves. In this manner, its inhibition can also be important for the indirect reduction of the progression of the erosion. In this present study, we can prove that the NaF has inhibiting potential over the dentin CCs, thus, suggesting a new inhibitor of CCs. With the results of this study, we can affirm that the MMPs are the main proteases in the progression of the dentin erosion and that the NaF has inhibiting potential in the dentin CCs.

Na dentina, a matriz orgânica desmineralizada tem um papel protetor contra desafios erosivos subsequentes. Porém, essa camada pode ser degradada por proteases, como as metaloproteinases da matriz (MMPs) e cisteína catepsinas (CCs). Recentemente, o uso de inibidores de proteases da matriz surgiu como uma importante ferramenta preventiva contra a erosão dentinária. Entretanto, o(s) mecanismo(s) exato(s) pelo(s) qual(is) os inibidores de proteases podem prevenir a erosão dentinária, bem como os tipos de proteases mais envolvidas neste processo ainda não são completamente conhecidos. O projeto foi desenvolvido em 2 subprojetos, com os seguintes objetivos: A)Subprojeto 1:Avaliar o papel das proteases na progressão da erosão dentária; B)subprojeto 2: Testar o potencial inibitório do NaF em CCs dentinárias. Para cumprir esses objetivos, foram utilizadas dentina de terceiros molares humanos para a preparação dos espécimes. A)Subprojeto1:Blocos de dentina (4 X 4 x 2 mm) (n=119) foram obtidos de raízes. Os espécimes foram divididos em 7 grupos de acordo com o seu tratamento (E-64, inibidor especifico II de catepsinas B, clorexidina, galardina NaF, placebo) ou sem tratamento, géis foram aplicados uma única vez sobre a superfície e feito o desafio erosivo (90s, 4x por dia por 5 dias) e feita analise perfilométrica. Os espécimes foram incubadas em solução contendo colagenase de Clostridium histolyticum tipo VII por 96hrs e então feita uma segunda analise perfilometrica para se determinar a espessura da MOD. Dois espécimes foram separados para análise de microscopia eletrônica de varredura. B)Subprojeto 2: Palitos de dentina (6 mm X 2 mm X 1 mm) (n=60) foram cortados da porção médio coronária dos dentes e completamente desmineralizados por imersão em EDTA 0,5 M (pH7,4) por 30 dias e lavados em água deionizada sob constante agitação a 4ºC por 72 h. Os espécimes foram divididos em 6 grupos (E-64, NaF e controle negativo, pH 5,5 ou 7,2) e incubados em saliva artificial contendo seus respectivos inibidores por 24 h 7 dias e 21 dias; ao termino de cada período, os espécimes eram pesados para avaliar a perda de massa e analisada a presença de CTX. A)Subprojeto 1: a perda de tecido desmineralizado (m, média± SD) foi: CHX 8,4±1,7b, Gala 8,6±1,9b, IECB 9,6±1,4a, E64 9,9±1,3a, NaF 9,9±1,7a, P 10,9±2,2a, ST 11,0±1,5a. A perda de tecido mineralizado foi: CHX 15,4±2,2b, Gala 16,0±1,8b, IECB 17,6±2,4a, E64 17,6±2,0a, NaF 17,3±2,8a, P 19,1±2,1a, ST 18,9±2,4a. Os inibidores de MMP reduziu significativamente a perda de matriz orgânica e tecido mineralizado em comparação com os outros grupos (p<0,05). Não foi achada diferença significante entre a espessura da matriz orgânica desmineralizada remanescente (p=0,845). B)Subprojeto 2: Na perda de massa houve diferença significante em relação ao inibidor (F=20,047, p<0,0001) e tempo de incubação (F=222,462, p<0,0001) com significante interação entre esses critérios, nos período de menor tempo de incubação, a perda foi similar para todos os grupos testados, no período de maior tempo de incubação, o grupo contendo NaF demostrou os melhores resultados. Na analise de CTX, houve diferença significante em relação aos inibidores (F46,543, p<0,0001), pH (F=14,836, p<0,0004) e tempo de incubação (F=161,438, p<0,0001) com significante interação entre esses critérios, como ocorrido na perda de massa, não houve diferença estatística nos períodos de menor incubação. No período de maior tempo de incubação, mais uma vez o grupo NaF mostrou os melhores resultados. No valor acumulado de CTX, os grupos E64 e controle negativo tiveram os maiores valores de CTX acumulado, o grupo NaF, independente do pH mostrou redução significante em relação aos demais grupos. Após analise dos resultados dos dois subprojetos, podemos indicar que as MMPs são as proteases de maior importância na progressão da erosão dentinária, assim, sua inibição é de maior importância para a redução desta patologia. Mesmo as CCs não exercendo papel direto para a progressão da erosão, elas são efetivas na cascata da ativação de outras proteases, como as próprias MMPs. Com isso, sua inibição também pode ser importante para a redução indireta da progressão da erosão. Neste presente estudo, pudemos comprovar que o NaF tem potencial inibitório sobre as CCs dentinárias, assim, sugerindo um novo inbidor de CCs. Com os resultados deste estudo, podemos afirmar que as MMPs são as principais proteases na progressão da erosão dentinária e que o NaF tem potencial inibitório nas CCs dentinárias. / In the dentine, the demineralized organic matrix has a protector part against the following erosive challenges. Nevertheless, this layer can be degraded by proteases, like the matrix metalloproteinases (MMPS) and cystein cathepsins (CCs). Recently, the use of proteases of the matrix´s inhibitors, emerged as an important preventive tool against the dentinária erosion. However, the exact mechanisms from which the inhibitors of the proteases may prevent the dentin erosion, as much as the kinds of proteases more involved in this process are not completely known yet. Therefore, the general objective of this project was to investigate the part of the two main proteases of the matrix (MMPs and CCs) in the dental erosion. The project was developed in 2 subprojects, with the following objectives: A)Subproject 1: Evaluate the part of the proteases in the progression of the dental erosion; B)subproject 2: To test the NaF inhibitory potencial in the dentin CCs. To accomplish these objectives, human third molar dentin were used for the preparation of the specimens, obtained in the surgery and urgency clinics of FOB-USP (subproject 1) or granted by the University of Oulu (subproject 2). A) Subproject 1: Dentine blocks 4 X 4 X 2 mm) (n=119) were obtained from the roots of the obtained teeth. The specimens were divided in 7 groups according with their treatment. Gels containing inhibitors (E-64, specific cathepsin B inhibitor II, chlorhexidine, galardin NaF, placebo), or without treatment, were produced, applied only one time over the surface and made the erosive challenge (90s, 4x a day for 5 days) and made profilometric analysis. The specimens were incubated in a solution containing collagenase of Clostridium histolyticum type VII for 96 hours and then a second profilometric analysis was made to determine the thickness of the MOD. Two specimens were separated for the electronic microscopy scan analysis. B) Subproject 2: Dentine sticks (6 mm X 2 mm X 1 mm) (n=60) were cut from the medium coronary portion of the teeth and completely demineralized by immersion in EDTA 0,5 M (pH7,4) ifor 30 days and washed in deionized water under constant agitation in 4º C for 72 hours. The specimens were divided in 6 groups (divided by inhibitors: E-64, NaF and negative control, pH 5,5 or 7,2) and incubated in artificial saliva containing their respective inhibitors for 24 hours, 7 days and 21 days; by the end of each period, the specimens were weighted to evaluate the loss of mass and analised the presence of CTX. A)Subproject 1: the loss of demineralized tissue (m, média± SD) was : CHX 8,4±1,7b, Gala 8,6±1,9b, IECB 9,6±1,4a, E64 9,9±1,3a, NaF 9,9±1,7a, P 10,9±2,2a, ST 11,0±1,5a. The loss of demineralized tissue was: CHX 15,4±2,2b, Gala 16,0±1,8b, IECB 17,6±2,4a, E64 17,6±2,0a, NaF 17,3±2,8a, P 19,1±2,1a, ST 18,9±2,4a. The MMP inhibitors reduced significantly the loss of organic matrix and demineralized tissue in comparison with other groups (p<0,05). There was no significant difference found between the thickness of the remaining demineralized organic matrix.(p=0,845). B)Subproject: In the loss of mass, there was a significant difference in relation to the inhibitor (F=20,047, p<0,0001) and incubation time (F=222,462, p<0,0001) with significant interaction between these criteria, in the periods of lesser time of incubation, the loss was similar for all the tested groups, in the period of higher time of incubation, the group containing NaF demonstrated the best results. In the analysis of CTX, there was significant difference in relation the inhibitors (F46,543, p<0,0001), pH (F=14,836, p<0,0004) and time of incubation (F=161,438, p<0,0001)with significant interaction between these criteria, as occurred in the mass loss, there was no statistic difference in the period of lesser incubation. In the period of higher time of incubation, once again, the NaF group demonstrated the best results. The CTX accumulated value, the E64 groups and negative control had the greater accumulated values of CTX, the NaF group, regardlessof the pH, demonstrated significant reduction in relation to the other groups. After the analysisof the results of both subprojects, we can indicate that the MMPs are the proteases of greater importance in the progression of the dentin erosion, thus, its inhibition is of graeter importance for the reduction of this pathology. Even the CCs don´t playing the part directly for the progression of erosion, they are effective in the cascade of the activation of other proteases, like the MMPs themselves. In this manner, its inhibition can also be important for the indirect reduction of the progression of the erosion. In this present study, we can prove that the NaF has inhibiting potential over the dentin CCs, thus, suggesting a new inhibitor of CCs. With the results of this study, we can affirm that the MMPs are the main proteases in the progression of the dentin erosion and that the NaF has inhibiting potential in the dentin CCs.