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Das Cysteine-String-Protein in Drosophila melanogaster: Molekulare und funktionelle Analyse verschiedener CSP-Mutanten; Ein Modell zur räumlich und zeitlich kontrollierten CSP-Expression / The cysteine string protein in Drosophila melanogaster: Molecular and functional analysis of different CSP-mutants; A model for spatial and temporal controlled CSP-expressionReisch, Natasa January 2003 (has links) (PDF)
Die Exozytose von Neurotransmittern und Peptiden während der Verarbeitung und Weiterleitung von Reizen im Nervensystem wird durch eine komplexe Maschinerie von Proteinen reguliert. Das konservierte Cysteine String Protein (CSP), das gebunden an synaptische und andere sekretorische Vesikel vorliegt, konnte in den vergangenen Jahren als Teil in diesen Prozess eingeordnet werden. Die Frage nach der genauen Funktion von CSP während der Exozytose ist allerdings weiterhin offen. CSP-Nullmutanten in Drosophila melanogaster zeigen temperatursensitive Paralyse und eine extrem verkürzte Lebenserwartung, gepaart mit verminderter Fertilität. In larvalen Nerv-Muskel Präparaten kommt es bei Temperaturen über 29°C zu einem reversiblen Block der elektrophysiologisch messbaren synaptischen Transmission. Die Primärstruktur des Cysteine String Proteins kann in folgende konservierte Sequenzabschnitte unterteilt werden: eine N-terminale Protein Kinase A Phosphorylierungsstelle, eine Region mit Homologie zu einer charakteristischen Domäne von DnaJ-Proteinen (DnaJ-Domäne), einen als Linkerregion bezeichneten Abschnitt, eine cysteinreiche Sequenz, die bei Drosophila aus dem namensgebenden Strang von 11 aufeinanderfolgenden Cysteinen flankiert von 2 Cysteinpaaren besteht, und einen schwächer konservierten C-Terminus, in dem sich auch einzelne Spleißvarianten unterscheiden. Versuche mit Vertebraten konnten zeigen, dass CSP in einem trimeren Komplex aus Hsc70/CSP/SGT vorkommt und bei der Exozytose wahrscheinlich als molekulares Co-Chaperon wirkt. Der Cysteinstrang liegt mehrfach palmityliert vor und ist für die Zielfindung des Proteins zur Vesikelmembran essentiell. In vorangegangenen Arbeiten wurde begonnen, bei Drosophila durch gezielte Mutagenese und Keimbahntransformation die Rolle des Cysteinstrangs, der Linkerregion und des C-Terminus für die Funktion des CSP zu analysieren. In der vorliegenden Dissertation wurden in transgenen Fliegen die Eigenschaften von Isoformen mit vier unterschiedlich mutierten Varianten des Cysteinstrangs (CSLP, SCSP, CLP, SSP) und je Deletionen in der Linkerregion (LΔ8) und im C-terminalen Bereich (CΔ27) charakterisiert. Die subzelluläre Verteilung und veränderte Membranbindungseigenschaften dieser Proteine wurden mithilfe von Membranfraktionierung und Glycerindichtegradienten von Homogenaten der transgenen Mutanten aufgezeigt. Die Isoformen CLP und SSP sind aufgrund der fehlenden Palmitylierung nicht an die Membran der synaptischen Vesikel gebunden, während die Isoform CSLP sowohl in der Vesikelmembranfraktion als auch als lösliches Protein nachgewiesen werden kann. Die flankierenden Cysteinpaare und die verbliebenen Cysteine in den Isoformen CSLP und SCSP erfüllen offenbar noch teilweise die Aufgabe des Cysteinstrangs bei der Zielfindung der Proteine. Eine Depalmitylierung mit Hydroxylamin löst das verkürzte SCSP Protein ebensowenig aus der Membran wie das intakte CSP. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen stehen im Einklang mit immunhistochemischen Befunden. Die Deletion bzw. Substitution der zentralen 11 Cysteine in den Isoformen CSLP, CLP und SSP äußert sich in den transgenen Fliegen in einer gleichmäßigeren Verteilung der Proteine, die nicht mehr wie im Wildtyp auf das synaptische Neuropil beschränkt ist. Keine der Isoformen mit verändertem Cysteinstrang ist in der Lage die Funktion des wildtypischen CSP zu übernehmen, da die adulten transgenen Fliegen den temperatursensitiven Phänotyp und eine kurze Lebensdauer ähnlich den Csp-Nullmutanten zeigen. Die Proteinisoformen LΔ8 und CΔ27 dagegen lassen in den biochemischen Analysen keine Abweichung vom Wildtyp erkennen und weisen auch eine wildtypische Verteilung in Kryostat-Gehirnschnitten auf. Die Deletion in der Linkerregion in der Isoform LΔ8 scheint die Funktion des CSPs allerdings einzuschränken, da die entsprechenden transgenen Fliegen bereits bei 38°C, wildtypische Tiere dagegen erst bei 40°C paralysieren. Die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen Drosophila CSP und Syntaxin konnte für die transgen exprimierte größte CSP Isoform CSP1 in Immunpräzipitationsexperimenten mit Drosophila-Kopfhomogenat bestätigt werden. Die Frage nach einer Interaktion zwischen Syntaxin und den anderen untersuchten mutierten CSP-Isoformen bleibt dagegen offen. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Versuch, mithilfe des UAS/Gal4- und des Flippase/FRT -Systems die CSP-Expression räumlich und zeitlich zu kontrollieren. Dazu wurde aufgrund von Datenbankangaben eine minimale FRT-Sequenz aus Oligonukleotiden mit entsprechenden Linkern konstruiert. Das gesamte Csp-Gen beziehungsweise die Csp cDNA1 einschließlich der regulatorischen Sequenzen wurde zwischen zwei gleichgerichteten FRT-Sequenzen pW8 eingebracht. Die Keimbahntransformation führte zu mehreren transgenen Fliegenlinien. Nach aufwendigen Kreuzungen mit Gal4-, UAS-Flippase- und Csp-Null-Linien entstanden Fliegen im CSP-Nullhintergrund, welche eine durch die verwendete Gal4-Linie definierte Expression von Flippase zeigten und das FRT-Konstrukt trugen. Diese Fliegen sollten in Flippase positiven Bereichen keine CSP-Expression mehr zeigen. Verhaltensanalysen an solchen Tieren bei normaler und erhöhter Temperatur könnten dann Aufschluss über die Funktion der Zellen ohne CSP-Expression geben. Leider konnten die erwarteten Veränderungen in der CSP-Expression nicht beobachtet werden, obwohl alle Konstrukte sich nach einer Überprüfung als intakt erwiesen haben. Die Ursache für die fehlende Rekombination zwischen den FRT-Sequenzen ist möglicherweise in einer zu geringen Länge dieser Zielsequenz der Flippase zu suchen. Im dritten Abschnitt der Arbeit wird der Csp-Genlokus und seine benachbarten Gene vorgestellt, und die möglichen Auswirkungen der Deletionen in den zur Verfügung stehenden Mutanten CspU1, CspU1w und CspK16 diskutiert. Aufgrund der Daten aus dem Drosophila Genomprojekt lag die Spekulation nahe, dass der Phänotyp der Deletionsmutanten auch durch eine veränderte Expression der benachbarten Gene stromab- und stromaufwärts des Csp Gens beeinflusst werden könnte. Die Auswertung eines Northern Blots von PolyA+-RNA adulter Fliegen, sowie einfache Verhaltenstests an vorliegenden und neu generierten CSP-Nullmutanten konnten diesen Verdacht allerdings nicht bestätigen. / Exocytosis during synaptic transmission is regulated by a complex machinery of numerous proteins. CSPs (cysteine string proteins), conserved from C.elegans to mamals, are attached to synaptic vesicle membranes and other secretory granules. They were therefore implicated to play a distinct part in this regulated process. However the exact role of the CSP protein in exocytosis is not yet known. Studies of Drosophila in null mutants for the Csp gene revealed a temperature sensitive paralytic phenotype, severely shortened lifespan and fertility. Exposure of larval nerve-muscle preparations to elevated temperatures (>29°C) lead to a reversible block of neurotransmitter release in electrophysiological measurements. The primary structure of the cysteine string protein is characterized by distinct conserved domains: a N-terminal protein kinase A (PKA) phosphorylation site, a region showing high homology to a domain found in DnaJ proteins (DnaJ-domain), a region called linker domain, a cysteine rich region, which in Drosophila comprises the characteristic string of 11 cysteines flanked by two additional pairs of cysteines, and a less conserved C-terminal region, which is absent in various splice variants. Experiments using vertebrates showed that CSP is part of a trimeric complex of Hsc70/CSP/SGT and may possibly act as co-chaperone during exocytotic processes. The cysteine string is found to be modified with multiple palmitoyl residues and appears to be essential for targeting of the protein to the vesicle membrane. In earlier studies mutagenesis and germ-line transformation were used to initiate an analysis on the role of the cysteine string, the linker domain and C-terminal region for CSP function. The present thesis extends this work by characterizing in transgenic flies four different mutated cysteine string isoforms (CSLP, SCSP, CLP, SSP) and deletions affecting the linker domain (LΔ8) and C-terminal region (CΔ27) using transgenic flies. The subcellular distribution and altered membrane binding properties of the mutated isoforms were analyzed using glycerol gradients and membrane fractionation. Due to the lack of palmitoylation CLP and SSP are exclusively found as soluble proteins in the cytosol whereas CSLP can also be found attached to vesicle membranes in membrane fractions. The flanking and remaining cysteines in the isoforms CSLP and SCSP apparently are able to partially direct the proteins to the membrane. The shortened cysteine string in SCSP is sufficient to induce membrane binding and is as resistant to depalmitoylation with hydroxylamine as wildtype CSP. The biochemical results correspond to the immunohistochemical findings, which show an almost homogenous distribution of the proteins CSLP, CLP and SSP, unlike the wildtype staining which is confined to neuropil regions in the adult brain. The mutant isoforms with deleted or substituted cysteine string do neither rescue the temperature sensitive phenotype nor the short life span observed in CSP-null mutants. In contrast the proteins LΔ8 and CΔ27 exhibit wildtype properties in the biochemical assays and the staining pattern of the adult brain. The deletion LΔ8 seems to interfere with regular CSP function in some way, as these transgenic flies paralyze at 38°C whereas wildtype flies paralyze at 40°C. The previously described interaction of CSP and syntaxin in Drosophila could be confirmed by precipitating syntaxin together with the largest CSP isoform CSP1 from Drosophila head homogenates using an antibody against CSP. A possible disruption of this interaction in the mutant transgenic flies could not be shown and remains to be investigated. The second part of this work describes the attempt to temporally and spatially regulate CSP expression by employing the UAS/Gal4- and flippase/FRT-system. Using database information a minimal FRT-sequence with apprropriate linkers was generated from oligonucleotides. The entire Csp gene or Csp cDNA1 with necessary regulatory sequences was ligated between two FRT sites and inserted into the transformation vector pW8. After extensive crossing of transgenic flies carrying the FRT-construct with Gal4-,UAS-flippase-, and Csp-null-lines flies were obtained which expressed the flippase in defined areas of Gal4 expression and contained the FRT construct, all in Csp-null background. Areas positiv for flippase expression should loose transgenic CSP expression. Behavioural analyis of these flies at normal and elevated temperatures should provide functional information on the cells lacking CSP. Unfortunately no differences in behaviour or staining pattern of adult brain could be detected, although all constructs were proven to be functional. The lack of recombination events might be due to the reduced length of the flippase target sequence used. The third project presents the Csp-locus and its neighbouring genes in Drosophila. The possible influence of deletions in the CSP null mutants CspU1, CspU1w and CspK16 on the expression of neighbouring genes are discussed. Based on sequence data offered by the Drosophila genome project it was speculated that these genes might influence the mutant phenotype. Northern blotting of adult head polyA+-RNA, simple tests of behaviour of already known and newly generated Csp null mutants could not confirm this speculation.
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Das Cystein String Protein von Drosophila melanogaster - Invivo-Funktionsanalyse verschiedener Proteindomänen am Modellsystem der larvalen neuromuskulären Synapse / The Cysteine string protein of Drosophila melanogaster - Invivo-functional analysis of different protein domains using the larval neuromuscular junction as a model systemLeibold, Christian January 2003 (has links) (PDF)
Cystein String Proteine (CSPs) wurden als synaptische Vesikelproteine entdeckt. In Drosophila werden sie in den funktionellen Synapsen und sekretorischen Organellen aller Entwicklungsstufen exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass CSPs an der regulierten Neurotransmitterausschüttung beteiligt sind und mehrere, von Insekten bis zum Menschen konservierte Domänen besitzen: eine N-terminale Phosphorylierungsstelle der Protein Kinase A (PKA), eine J-Domäne mit 50%iger Homologie zum bakteriellen Chaperone-Protein DnaJ, eine Linker-Domäne, einen Cystein String aus elf aufeinander folgenden Cysteinen, die durch zwei Cystein-Paare flankiert werden und einen variableren C-Terminus. Es wurden Interaktionen mit den Proteinen HSC70, SGT, Syntaxin, Synaptobrevin/VAMP, verschiedenen Untereinheiten von G-Proteinen, Synaptotagmin, sowie spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen beschrieben. csp-Nullmutanten CspU1 von Drosophila melanogaster zeigen einen temperatursensitiven Phänotyp, in dem adulte Fliegen von CspU1 reversibel bei 37°C innerhalb von drei Minuten paralysieren. An der neuromuskulären Synapse dritter Larven von CspU1 kann bei nicht-permissiver Temperatur von 32°C eine reversible Blockade der synaptischen Transmission beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe des larvalen Nerv-Muskel-Präparats dritter Larven elektrophysiologische Untersuchungen an verschiedenen csp-Mutanten durchgeführt werden. Hierdurch sollte die Bedeutung der einzelnen Domänen für die Funktion von csp weiter aufgeklärt werden. Am larvalen Nerv-Muskel-Präparat von Drosophila ist eine Arbeit auf Einzel-Zell-Niveau möglich. Die Segmentierung, die wiederkehrende Anordnung von Muskeln und innervierenden Motoneuronen, sowie das Vorkommen vieler auch im Gehirn von Drosophila lokalisierter synaptischer Proteine machen die larvale neuromuskuläre Synapse für die vorliegenden Fragestellungen. Wie in vielen anderen Arbeiten, wurden elektrophysiologische Messungen an dem Longitudinalmuskel 6 durchgeführt. Alle Messungen evozierter Muskelpotentiale (EJP) wurden, wenn nicht anders erwähnt, mit 0,2Hz Stimulusfrequenz durchgeführt. Die Reiz-Intensität wurde an jedes Präparat individuell angepasst und betrug das 2 ½ -fache des Initial-Schwellenwertes, bei dem ein vollständiges EJP ausgelöst wurde. Zunächst konnte der in der Literatur beschriebene larvale Block der synaptischen Transmitterausschüttung bei erhöhter Temperatur nicht reproduziert, jedoch durch Rückkreuzungen der Nullmutante CspU1 gegen den Wildtyp w1118 wiederhergestellt werden. Das „Rescue“-Konstrukt scDNA1, welches die Grundlage für alle weiteren mutierten Formen von csp darstellt, rettete den larvalen temperatursensitiven Phänotyp im csp-Nullmutantenhintergrund von CspU1 vollständig. Larvale Mutanten der Linie SSP, bei denen der Cystein String durch einen Serin String ausgetauscht worden war (Serine-string protein), zeigten in Übereinstimmung mit den adulten Fliegen den bekannten temperatursensitiven Phänotyp. Larvale Mutanten der Linie CLP (Cysteine-less protein) zeigten im Gegensatz zu adulten Tieren dieser Linie keinen temperatursensitiven Phänotyp, sondern ein wildtypisches Verhalten. Für die Mutante L∆8, die im Nullmutantenhintergrund von CspU1 roc ein in der Linker-Domäne um acht Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimiert, wurden verschiedene elektrophysiologische Phänotypen beobachtet: Larven der X-chromosomalen Linie zeigten den bekannten temperaturabhängigen Block der synaptischen Transmission. Larven der Insertionslinie für das 3. Chromosom zeigten keine Temperatursensitivität, sondern wildtypisches Verhalten. In immunhistochemischen Untersuchungen konnte für die X-chromosomale Linie eine deutlich schwächere Expression des L∆8-Proteins beobachtet werden. Larven der Linie C∆27, die ein im C-terminalen Bereich von CSP um 27 Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimieren, im Nullmutantenhintergrund CspU1 roc konnten anhand des Phänotyps in zwei Gruppen unterteilt werden. Unabhängig vom Insertionsort zeigte eine Gruppe den bekannten larvalen temperatursensitiven Phänotyp. Die zweite Gruppe zeigte auch bei erhöhter Temperatur wildtypisches Verhalten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht, eine neue Deletionsmutante für csp durch Remobilisierung einer P-Insertion (P#1617, flybase, Bloomington) im ersten Exon zu erzeugen, da in der Nullmutante CspU1 möglicherweise auch benachbarte Gene betroffen sind. Nach Überprüfung der erzeugten Mutanten durch Western und Southern Blot, immunhistochemische Experimente und elektrophysiologische Untersuchungen am Nerv-Muskel-Präparat 3. Larven konnte keine Deletionsmutante mit temperaturabhängigem Phänotyp isoliert werden, die ausschließlich csp betraf. / Cysteine string proteins (CSPs) were detected as synaptic vesicle proteins. In Drosophila they are expressed in functional synapses and secretory organelles of all developmental stages. CSPs were shown to be involved in regulated neurotransmitter release and contain several domains, which are conserved from insects to man: N-terminal phosphorylation site for protein kinase A (PKA), “J”-domain with 50% homology to a bacterial chaperone-protein DnaJ, “linker”-domain, cysteine string consisting of eleven following cysteines, flanked by two pairs of cysteines and the more variable C-terminus. Interactions with the following proteins have been described: HSC70, SGT, Syntaxin, Synaptobrevin/VAMP, several subunits of G-proteins, Synaptotagmin, and voltage-dependent Ca2+-channels. Csp-null mutants (CspU1) of Drosophila melanogaster exhibit a temperature sensitive phenotype. Adult flies of CspU1 paralyse reversibly at 37°C within three minutes. At the neuromuscular junction of 3rd instar larvae of CspU1 a reversible blockade of synaptic transmission can be observed at non-permissive temperature of 32°C. Electrophysiological studies at the larval nerve-muscle-preparation of 3rd instar larvae of different csp-mutants were performed in this Ph.D. thesis in order to investigate the relevance of the different CSP domains for the function of csp. Using the larval nerve-muscle-preparation of Drosophila studies at single-cell-levels are possible. The clear segmentation, iterated position of the body wall muscles and localization of many proteins, which are also present in the brain, account for the larval neuromuscular junction as an ideal model-system for the study of synaptic transmission. As described in previous work, electrophysiological studies have been performed at longitudinal muscle 6. All recordings of evoked junction potentials (EJP) were performed with 0.2Hz stimulus frequency (if not described in a different way). Stimulus intensity was adjusted 2 ½ times to initial threshold for a complete EJP, individually for each preparation. In the beginning larval blockade of synaptic transmitter release as described in literature could not be reproduced. Backcrossing for 12 generations of CspU1 with w1118 could restore the temperature-dependent blockade of synaptic transmission in 3rd instar larvae. “Rescue”-construct scDNA1, which was further used as template for all mutated forms of CSP used in this study, completely rescued the larval temperature-sensitive phenotype in csp-null mutant background. Larval mutants of SSP (serine-string protein, serine-string replaces cysteine-string) showed the temperature-sensitive phenotype, as known from their adult flies. In contrast to their adult flies larval mutants of CLP (cysteine-less protein) showed no temperature-sensitive phenotype, but wild type-like behaviour. For the mutant L∆8 (deletion of eight conserved amino acids of linker domain) in null mutant background of CspU1 roc two different phenotypes could be observed: The X-chromosomal strain showed the known temperature-dependent blockade of synaptic transmission. In contrast, 3rd instar larvae of the strain with insertion on the 3rd chromosome showed no temperature sensitivity, but wild type-like behaviour. In immunhistochemical staining a weaker L∆8-protein expression could be observed for the X-chromosomal line. Due to their different phenotype and independent of insertion locus, larval C∆27-mutants could be divided into two groups. One group revealed the known larval temperature-sensitive phenotype. The second group showed also at elevated temperature wild type-like behaviour. In the second part of the current work a new mutant for csp should be created because of the possibility that additional genes are influenced in the null-mutant CspU1. Therefore a deletion in the csp-Locus should be created in a jump-out mutagenesis. In the strain P1617 (flybaase, Bloomington) the PZ-element, which is located in the non-translated region of the 1st exon of csp, was remobilized. Characterization of the jump-out mutants by western and southern blot analysis, immunhistochemical experiments and electrophysiological studies at nerve-muscle-preparations of 3rd instar larvae failed to isolate a jump-out mutant with described temperature-dependent phenotype and affection only of csp.
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