Universiẗat, Diss., 2008--Frankfurt (Main). / Engl. Übers. des Hauptsacht.: Studies on the structure-function relationship of the cytochrome bc1 complex from Paracoccus denitrificans.

Techn. Universiẗat, Diss., 1999--Berlin.

University, Diss., 2004--Jena.

The system of mixed function oxygenase (MFO system) participates in significant roles in the metabolism of endogenous compounds and xenobiotics. This system contains cytochrome P450, NADPH:cytochrome P450 reductase, and also there are assigned NADH: cytochrome b5 reductase and cytochrome b5. It was proved that cytochrome b5 can stimulate or inhibit cytochrome P450 (CYP)-dependent reactions and even change the ratio of resulting metabolites. The mechanism of cytochrome b5 action has not been fully elucidated yet. Elucidation of protein-protein interactions in MFO system and determination of topology of this system could explain the mechanism of cyt b5 action. The covalent cross- linking technique is suitable method for identifying protein-protein interactions within the membrane. Cytochrome b5 contains 3 methionines and in 2 cases the methionines are localized in a short hydrophobic C-terminal membrane anchor. Interactions with cytochrome P450 in the membrane environment can be identified by substitution of two methionine for photoactivatable analogue of methionine (photo-methionine) and subsequent photoactivation. This work is focused on expression and isolation of photo-cytochrome b5 (photo- cyt b5), cytochrome b5 analogue with incorporated photo-methionine. Conditions for photo-methionine...

Tumour-related diseases are the second most common cause of death in the Czech Republic, right after cardiovascular diseases. Nanomedicine - a novel scientific discipline - shows captivating potential in anticancer treatment with help of so called nanotranporters - nanoparticles capable of transporting other molecules. Encapsulation of a cytostatic drug into a nanoparticle improves its pharmacokinetical and pharmacodynamical properties which helps to reduce adverse side effects on non-tumour healthy tissue. In the scope of this diploma thesis apoferritin - apo-form of ferritin - was studied, since this nanotransporter shows promise for clinical use in anticancer treatment. Effect of hepatic microsomes from premedicated and control rats on biotransformation of doxorubicin cytostatic (Dox) in free and apoferritin nanoparticle-bound forms was investigated at pH 7,4. Over the course of biotransformation two types of metabolites - M1 and M2 - were observed. Regardless of the employed inductor all studied microsomes have exhibited similar metabolism of free doxorubicin and its apoferritin encapsulated form (ApoDox). Our results also imply that doxorubicin can be metabolically processed by rat hepatic microsomes in both free and ApoDox form with similar efficiency. We have also studied biotransformation...

Cytochromes P450 form a large family of hemoproteins. Some of them are responsible for the metabolism of endogenous substrates, but their major role is in detoxification of exogenous substrates (xenobiotics), some of them are activated to reactive species forming covalent adducts with DNA and increasing intracellular oxidative stress. Cytochrome P450 are considered by very promiscuous in terms of their substrate specificity, thus one enzyme can typically oxidize many substrates. Cytochrome P450 1A1 prefers a planar aromatic compounds (e.g. polycyclic aromatic hydrocarbons, azo dyes, etc.). Cytochrome P450 1A2 elicits similar substrate specificity, but prefers slightly basic aromatic derivatives, for example caffeine. This work focuses on (i) the preparation of expression vectors containing genes encoding human cytochromes P450 1A1 and 1A2, (ii) their consequent expression in heterologous system followed by (iii) isolation of corresponding proteins. The genes coding both proteins were modified and transferred from older vectors to the more efficient to expression plasmids pET-22b. However, the new constructs did not produce stable native proteins. The modified genes were therefore transferred to the original expression plasmids pCW. The problem with the incorporation of native human form of...

Ellipticine is an alkaloid isolated from Apocynaceae plants exhibiting significant antitumor and anti-HIV activities. Cytochromes P450 (CYP) and peroxidases are the enzymes participating in metabolism of ellipticine. This process provides activation and detoxication metabolites of ellipticine. The CYP enzymes, which participate in oxidation of ellipticine in different tissues (liver, lung and kidney) of rat, a model organism simulating the fate of ellipticine in humans have already been identified. In this work, the effects of ellipticine on contents and catalytic activities of CYPs and other components of the mixed-function oxidase (MFO) system in this animal system were studied. For detection of contents of CYPs and other components of the MFO system, spectroscopic and electrochemical methods were used. To determine catalytic activities of CYPs and NADPH:cytochrome P450 reductase, reactions with specific substrates of these enzymes were utilized. The results found in this study demonstrate that expression and catalytic activity of CYP1A is induced by ellipticine in all of the tested organs (liver, kidney and lung) of rats treated with the drug. Moreover in liver, the cytochrome b5 expression is also induced. In addition, in this organ, expression and catalytic activity of CYP3A was increased by...

13 Abstract An environmental pollutant and a human carcinogen benzo[a]pyrene (BaP) is after its activation with cytochrome P450 (CYP) able to covalently bind to DNA. In the thesis, one of the target was to investigate an influence of individual components of mixed function monooxygenase (MFO) system on metabolism of benzo[a]pyrene and generation of adducts of activated BaP with DNA. The study was particularly focused to increase our knowledge on the effect of cyt b5 on metabolism of BaP by cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) and its potential to serve as a donor of electrons during the reaction cycle of this cytochrome P450. The effect of cyt b5 on generation of BaP metabolites and adducts of BaP with DNA was investigated. In addition the effect of two different expression systems for cytochrome P450 1A1 (prokaryotic and eukaryotic) was also studied. The influence of cyt b5 on oxidation another xenobiotic compound, a plant alkaloid ellipticine that exhibit antitumor activities, was also investigated. Its pharmacological efficiency, as well as side effects depends on its metabolic activation by cytochrome P450. CYP3A4 is very important for ellipticine activation and therefore this enzyme was used in our experiments. Furthermore, a suitability of rat as a model organism mimicking the metabolic fate of BaP...

Cytochromes P450 are the major xenobiotics converting enzymes. They are classified as mixed function monooxygenases (MFO). Isoform 1A1 is a extrahepatic form found mainly in the lung and other tissues. It is strongly induced by polycyclic aromatic hydrocarbons and their derivatives via the Ah receptor. As a marker reaction for this enzyme can be used hydroxylation of Sudan I, which has previously been widely used as a azo dye in industry, but since 1980s it is banned for coloring food and cosmetics for its negative influence on the organism. NADPH:cytochrome P450 reductase is the major electron donor for cytochrome P450 catalyzed monooxygenation reactions. Another electron carrier for cytochrome P450 catalyzed reactions is cytochrome b5. It was shown that cytochrome b5 can stimulate, inhibit or have no effect on P450 catalyzed reactions. This thesis aims to evaluate the influence of the ration between NADPH:cytochrome P450 reductase and cytochrome b5 on cytochrome P450 1A1 catalyzed Sudan I hydroxylation. The main goal is to characterize the influence of electron donor and electron transfer ratios on hydroxylation of Sudan I, and to determine the kinetic parameters KM and VMAX for selected protein ratios. Partial aims of the thesis were to characterize the recombinant proteins used in this study...

Folate sind als Überträger von C1-Fragmenten verschiedener Oxidationsstufen direkt an der Nukleinsäuresynthese beteiligt und spielen somit eine entscheidende Rolle im Zellstoffwechsel. So kann ein suboptimaler Folatstatus zur Ausprägung einer klinischen Symptomatik führen, die sich primär in Zellen mit hoher Teilungsrate manifestiert. Dabei gilt die megaloblastäre Anämie als Leitsymptom für einen akuten Folatmangel. Herausragende Bedeutung besitzen Folate in der Schwangerschaft, wo ihnen bei der Entwicklung des fetalen Nervensystems eine besondere Rolle zukommt. Bei einem zu niedrigen Serumfolatspiegel der Mutter steigt das Risiko für embryonale Missbildungen wie Neuralrohrdefekte stark an. Die weitere medizinische Relevanz der Folate steht momentan im Fokus der Forschung, wie z. B. der protektive Effekt in Bezug auf bestimmte Krebsformen, die Risikoreduktion für verschiedene kardiovaskuläre Erkrankungen sowie Zusammenhänge zwischen dem Folatstatus und neurologischen Störungen (Alzheimer, Depressionen). Allerdings kann Folat als essentielles Vitamin von Säugetieren nicht selbst synthetisiert werden, sondern muss aus externen Quellen über den Verdauungstrakt aufgenommen werden. Die Resorption aus dem Darm erfolgt nach aktuellem Kenntnisstand insbesondere über den Reduced Folate Carrier (RFC, SLC19A1) und den Proton-Coupled Folate Transporter (PCFT, SLC46A1). Trotz der Existenz dieser spezifischen Transporter ist der Folatmangel des Menschen der häufigste Vitaminmangel in Mitteleuropa. Er lässt sich durch eine ausschließlich ernährungsphysiologische Problematik nur unzureichend erklären. Interessanterweise besitzen sowohl das PCFT-Gen als auch das RFC-Gen in ihrer Promoterregion verschiedene Regulationselemente, unter anderem auch funktionell aktive DREs (Dioxin Response Element), die als Bindungsstelle für einen ligandenaktivierten Transkriptionsfaktor, den nukleären Arylhydrocarbon-Rezeptor (AhR), dienen. DREs wurden bisher hauptsächlich bei fremdstoffmetabolisierenden Enzymen wie z. B. Cytochrom P450-Isoenzymen gefunden und vermitteln bekanntermaßen die toxischen und karzinogenen Effekte von AhR-Liganden. Von besonderem Interesse sind in diesem Zusammenhang ubiquitär verbreitete Umweltkontaminanten wie die polyzyklischen und die halogenierten aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAK, HAK), da sie in der Umwelt sehr persistent sind und sich dadurch in der Lebensmittelkette anreichern. Infolgedessen wurde im Rahmen dieser Studie der mögliche Einfluss von AhR-Liganden wie TCDD (2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxin) und B[a]P (Benzo[a]pyren) auf die carriervermittelte intestinale Folatresorption beim Menschen untersucht sowie die Regulation der Transportproteine RFC und PCFT auf transkriptioneller Ebene experimentell überprüft. Als adäquates in vitro Modell diente dabei die humane Kolonzelllinie LS180, für die zunächst eine Charakterisierung erfolgte. Mittels RT-PCR wurde der Nachweis erbracht, dass alle am Folattransport beteiligten Import-und Exportcarrier auf mRNA-Ebene exprimiert werden. Für die Transportproteine RFC und PCFT erfolgte über den Western Blot auch der Nachweis auf Proteinebene. Die Funktionalität der AhR-Signalkaskade, die über methylcholanthrenartige Induktoren wie TCDD zur Induktion von Cytochrom P450 führt, konnte im Folgenden mittels Ethoxyresorufin-O-deethylase-Assay (EROD) überprüft werden. Es zeigte sich nach Induktion mit TCDD (0,01 - 10 nM) oder B[a]P (0,01 - 1 μM) über 12 – 96 h ein hochsignifikanter, dosis- und zeitabhängiger Effekt auf die Cyp1A1 vermittelte Enzymaktivität der Ethoxyresorufin-O-deethylase in den LS180-Zellen. Dabei konnten ligandenabhängige Unterschiede im Induktionsmuster ermittelt werden. Im Anschluss wurde im intestinalen Zellmodell die initiale konzentrations- und zeitabhängige Folataufnahme bei pH 5.5 über funktionelle Aufnahmeversuche mit Tritium-markierter Folsäure untersucht und charakterisiert. Sie stellte sich als aktiver, sättigbarer Prozess dar, wobei in den unbehandelten LS180-Zellen ca. eine Verdreifachung der intrazellulären Radioaktivität über einen Zeitraum von 2,5 min beobachtet werden konnte. Als kinetische Parameter wurden ein Km-Wert von 27,91 μM sowie ein Vmax-Wert von 281,2 pmol/min berechnet. Nachfolgende Untersuchungen mit den spezifischen Inhibitoren Raltitrexed (RTX) und Pemetrexed (PMX) konnten zeigen, dass sowohl PCFT als auch RFC an der funktionellen Folsäureaufnahme bei einem pH-Wert von 5.5 in dem gewählten Versuchsaufbau beteiligt sind. Der RFC scheint jedoch einen etwas höheren Anteil an der Gesamtaufnahme zu haben als der PCFT. In LS180-Zellen, die vorher mit den Modellsubstanzen TCDD (1 bzw. 10 nM) oder B[a]P (0,1 bzw. 1 μM) über 24 - 120 h inkubiert wurden, konnte eine zeit- und dosisabhängige, statistisch signifikante Reduktion der carriervermittelten Folatresorption beobachtet werden, wobei die maximale Verminderung der Aufnahmerate ca. 75 % betrug. Da sich dieser Effekt durch die AhR-Antagonisten Salicylamid (SAL) und CH-223191 (CH) dosisabhängig umkehren ließ, erfolgt die Regulation vermutlich über den AhR-Signalweg. Um den Mechanismus der Regulation zu klären, wurde mit Hilfe der quantitativen qRT-PCR unter Verwendung von TaqMan-Sonden die Genexpression von RFC und PCFT nach Vorbehandlung mit 1 - 10 nM TCDD oder 0,1 – 1 μM B[a]P über 12 - 120 h untersucht. Analog zu den Aufnahmeversuchen konnte hier eine zeit- und dosisabhängige Reduktion beider Transporter auf transkriptioneller Ebene beobachtet werden. Auch führte eine Vorbehandlung mit CH und SAL wiederum zu einer Umkehr des Effektes, wobei CH wahrscheinlich einen ligandenselektiven AhR-Antagonisten darstellt. Zusammenfassend konnte durch die vorliegende Arbeit nachgewiesen werden, dass Cytochrom P450-Induktoren über die AhR-Signalkaskade die carriervermittelte Folatresorption in humanen Kolonzellen herabregulieren. Es erscheint anhand der gewonnen Erkenntnisse möglich, dass die Folathomoöstase durch verschiedene Umweltkontaminanten wie z. B. TCDD negativ beeinflusst werden kann und als Folge daraus auch eventuell der Folatmangel der Bevölkerung in Industrienationen zumindest teilweise erklärbar wird. Es ist darüber hinaus denkbar, dass auch andere Fremdstoffe die Folataufnahme beeinflussen, da große planare Strukturen häufig über den AhR-Weg wirken. Weiterführende Studien sind notwendig, um das Verständnis für den Einfluss von Umweltkontaminanten auf die intestinale Folataufnahme zu verbessern.