Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der zweidimensionalen Dünnschichtchromatographie (DC) und deren quantitativer Auswertung. Es wird auf die Grundlagen der DC eingegangen. Darüberhinaus werden die Vorgehensweisen der quantitativen Auswertung gegenübergestellt und bewertet. Besonders behandelt werden die nichtlinearen Regressionsmethoden. Die in dieser Arbeit verwendete Entwicklungstechnik wird erklärt und die Vorteile beschrieben. Der im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Scanner und die dazugehörige Software werden vorgestellt. Als Lichtquelle dient eine 30 W Deuteriumlampe, die ohne Sperrfilter betrieben wird. Dies ermöglicht die Verwendung von Licht auch im Bereich von 198-210 nm. Auf einen Betrieb der Lichtquelle im Vakuum wurde verzichtet. Die Einblendtechnik der Lichtstrahlen in den Lichtwellenleiter wurde nicht verändert. Der bewegliche Teil des Scanners besteht aus einem Kreuztisch, dessen Vorschubeinheiten um 90° versetzt angebracht wurden, um die Platte in x- und in y-Richtung bewegen zu können. Die Wahl der Spindelsteigung ermöglicht eine Schrittweite von 0.1 mm im Bedarfsfall. Jede Vorschubeinheit wird durch eine eigene Steuerkarte angesprochen. Damit kann in beide Richtungen unabhängig voneinander verfahren werden. Die Vorschubgeschwindigkeit ist in zwei Stufen wählbar. Um den Intensitätsverlust bei der Lichtübertragung gering zu halten und einen modularen Aufbau realisieren zu können, wurde als Übertragungsmedium zwischen Lampe und Platte ein Lichtleiter gewählt. Dieser ist in der Lage, sowohl eine als auch mehrere Wellenlängen zu übertragen. Durch den Einsatz eines optimierten Faserbündels, das mit Wasserstoff begast wurde, um die Bildung von Farbzentren zu verhindern, kann die Alterung stark verlangsamt werden. Die Dämpfung der Lichtintensität innerhalb der Faser spielt durch die Verwendung kurzer Fasern nur eine untergeordnete Rolle. Als Detektionseinheit werden Photodiodenarrays verwendet, die 256 bzw. 512 Dioden besitzen. Eingebaut wird jeweils nur das vorjustierte Array, das auf eine Platine aufgebracht ist, die die Elektronik zum Auslesen sowie die Möglichkeit zur Ansteuerung des Auslesevorganges bereits enthält. Die Minimalkonfiguration erlaubt das Verwenden eigener, für den Einsatzzweck optimierter Bauteile. Die erstellte Software verarbeitet die registrierten Daten und ordnet die Signale den entsprechenden Wellenlängen zu. Die Rohdaten werden nach der bekannten Gleichung von Kubelka und Munk in Remissionswerte umgerechnet. Ein neues Verfahren zur Glättung von zweidimensional verrauschten Daten wird eingeführt, mit Hilfe dessen die Signale in eine verwertbare Form übergeführt werden. Hierzu wird eine Regressionsrechnung in zwei Dimensionen mittels eines Polynoms durchgeführt. Die Glättungsbreite kann variabel für beide Dimensionen bestimmt werden. Die Faltungsoperation kann im Gegensatz zu bisher bekannten Verfahren auch während der Auswertung durchgeführt werden. Statische Faltungsoperatoren werden nicht mehr benötigt. Peaks werden gesucht und ihre Lage mit Hilfe einer Basisfläche korrigiert. Diese Fläche berücksichtigt Matrixeinflüsse der Platte, Schwankungen im Lichtstrom der Lampe und Änderungen der mobilen Phase während der Entwicklung. Die transformierten und geglätteten Daten werden in zwei Dateien geschrieben, die sich nur in der Art der Speicherung unterscheiden, um sie mit Fremdprogrammen weiterverarbeiten zu können. Es wird die Möglichkeit untersucht, Remissionsspektren unterschiedlicher Herkunft und UV-Spektren miteinander zu vergleichen. Um auf umfangreiche existierende UV- Spektrenkataloge zurückgreifen zu können, wird eine Möglichkeit gesucht, mit deren Hilfe die Remissionsspektren UV-Spektren zugeordnet werden können. Ein automatisiertes Vorgehen alleine reicht nicht aus, der Eingriff des Benutzers ist unerläßlich. Bei Remissionsdaten findet eine nicht reproduzierbare Verschiebung der Wellenlängen statt, die ein direktes Inbezugsetzen verhindert. Es wird ein Auftrageschema vorgestellt, das auch für quantitative Analysen 2D- entwickelter Platten anwendbar ist. Zusätzlich zu dem zu untersuchenden Gemisch werden 3 Standardgemische bekannter Konzentration und Zusammensetzung aufgetragen. Die erste Entwicklung erfolgt von gegenüberliegenden Seiten bis zur Mitte der Platte, nach Trocknen und Drehen um 90° wird die zweite Entwicklung ebenfalls beidseitig durchgeführt. So wird die Plattenoberfläche optimal ausgenutzt und die Kriterien zur quantitativen Auswertung werden erfüllt. Die Leistungsfähigkeit des neu eingeführten Glättungsalgorithmus wird gezeigt. Auf die Besonderheiten einer Auswertung anhand des Peakvolumen und nicht wie bisher anhand der Peakfläche wird eingegangen. Ein Datensatz von aufgenommenen Spektren wird nach der Verarbeitung gezeigt. Das entwickelte System aus Hard- und Software ist in der Lage, jeden Punkt auf der Platte anzusteuern und Daten zur weiteren Auswertung in genügend hoher Genauigkeit zu liefern. / The presented thesis deals with quantitative two-dimensional thin-layercchromatography. The basics of thin-layer chromatography are covered. Known quantitation methods are compared and evaluated with respect to non-linear regression methods. These play a prominent role in thin-layer chromatography. The developing method used in this work is described and the advantages are shown. The scanner and software developed in this thesis are described. As a light emitting source a deuterium lamp was used that is operated without a limiting filter, allowing usage of light below 210 nm down to 198 nm. The operation of the lamp in vacuum is rejected. The connection of the lamp to the used optic fibre is not altered. The movable parts of the scanner consist of two motor-driven plates that run perpendicular to each other making movement in both x- and y- direction possible. The created system allows single steps down to 0.1 mm if necessary. Each moving plate is adressed by its own controller making independent movement in both directions possible. The speed of the moving plates is switchable in two steps, one of those being fast enough to bridge long distances, the other being precisely enough to position in a least oscillating way. In order to minimize the loss of intensity while transmitting the UV light and to realize a modular construction, fibre optics were used between TLC-plate and lamp. The fibre is capable of transmitting single or multiple wavelengths, respectivly. Optimization is done by treating the fibre in a hydrogen-atmosphere. This leads to the reduction of E'-centers and improvement of the lifetime-stability of the fibre optics. Normal attenuation plays a minor role because of the limited lenghts of the optics. A photodiodearray consisting of 256 and 512 diodes, respectivly, is used as a detection unit. Implemented is only the readily adjusted array fixed to a small controller. The controller offers the electronics for reading the array and for synchronizing the reading cycles. This minimum configuration allows the further usage of parts that are specialized for the required scanning process. The programmed software evaluates the registered data and sorts the signals to the corresponding wavelengths. Raw data is transformed to remission data by using the known equation of Kubelka and Munk. A new method of smoothing two-dimensional scattered data is introduced. It is done by a regression in two dimensions using a polynom. The smoothing width can be varied for each direction independently. This convolution can be carried out during evaluating the data whereas known methods have to determine the convolution integers in advance. Static convolution integers are not needed any more. Peaks are searched and their shape is stripped by using not only baseline but a basearea correction. This is done for correcting influences of the matrix, disturbances in the lightstream, and change of the mobile phase due to decomposition of the eluent mixture. Transformed and smoothed data are written in two files differing only by ways of storing data. A plain-text file is produced for importing the data into commercially available software. It is examined whether remission spectra of different sources and UV-spectra are comparable. In order to use existing UV-databases, a way of pairing remission and corresponding UV data is searched. An automatic approach is not sufficient, correction by the user is mandatory. In recording remission data, a non-reproducible shift of wavelengths is observed that prevents the direct comparing. A spotting scheme is presented that is usable for quantitative analysis of two-dimensional developped chromatograms. In addition to the examined mixture, three standards of known compounds and concentrations are transferred to the plate as well. The first development is carried out from opposing sides to the middle of the plate. After drying and switching 90° the second development is done from opposing sides also. This is done for using the surface optimally and meeting the requirements for quantitative evaluation. The power of the presented smoothing algorithm is shown. The specialities of evaluating the peak-volume instead of only the peak-area are dealt with. A dataset of recorded spectra is shown after evaluating. The developed system consisting of hard- and software is capable of moving to every point of the plate-surface and recording data for further evaluation in sufficient precision.

Die Rückstandsanalytik tierischer Lebensmittel ist eine anspruchsvolle Aufgabe aufgrund des hohen Lipidanteils der Proben sowie des sich stetig vergrößernden Wirkstoffspektrums. Heutzutage werden für die Probenaufarbeitung die DFG S 19 Methode, mit der vorrangig unpolare Analyten nachgewiesen werden und zunehmend die QuEChERS Methode eingesetzt, die insbesondere auf die Erfassung polarer Pestizide abzielt. In dieser Arbeit wurde eine moderne Multirückstandsmethode für Hühnereier entwickelt, um sowohl gas- als auch flüssigkeitschromatographisch (GC, LC) erfassbare Wirkstoffe zu analysieren. Dazu gehören unpolare PCBs, Pyrethroide und Organochlorpestizide, aber auch polarere Organophosphate, Triazole und Carbamate. Das Verfahren basiert auf der Extraktion mittels Matrix Solid Phase Dispersion, der Reinigung auf Grundlage einer modifizierten Gelpermeationschromatographie (GPC) und zwei verschiedenen Festphasenextraktionen (SPEs) für GC- und LC-erfassbare Pestizide sowie der Quantifizierung mittels GC- und LC-MS/MS. Dünnschichtchromatographisch wurde die effektive Entfernung hochmolekularer Lipide durch die modifizierte GPC und niedrigmolekularer Fette durch die SPEs belegt. Laut der für Ei durchgeführten Validierung erfüllten 164 der 172 untersuchten Pestizide und alle sechs PCBs die Leistungskriterien für die amtliche Rückstandskontrolle - zumeist am niedrigsten validierten Level (5 µg/kg bzw. 0,5 µg/kg). Ausnahmen bildeten sehr polare LC-Pestizide (z.B. Aminopyralid, Clopyralid, MCPA, Quinmerac) und pH-Wert-abhängige GC-Analyten (Nicotin, Tolylfluanid, Dichlofluanid), die auch mit den etablierten Verfahren schwierig zu analysieren sind. Weiterhin verdeutlichte die erfolgreiche Untersuchung von verschiedenen Ringversuchsmaterialien, dass die ursprünglich für Eier entwickelte Methode auch für mageres Geflügelfleisch und Sahne genutzt werden kann. Gegenüber den etablierten Verfahren wies die neue Methode deutliche Vorzüge auf. So belegte die Dünnschichtchromatographie, dass mit der neuen Methode Cholesterin, aber auch freie Fettsäuren besser abgetrennt werden als mit den etablierten Verfahren. Die neue Methode verbrauchte im Vergleich zur DFG S 19 Methode 46 % weniger Lösungsmittel und ermöglichte eine Verdopplung des Probendurchsatzes innerhalb von 8 h. Zudem eignete sich das entwickelte Verfahren laut den Validierungsdaten für GC-Analyten deutlich besser als die QuEChERS Methode und etwas besser als die DFG S 19 Methode (v.a. für Pyrethroide). Hinsichtlich der LC-Analyten unterschieden sich die neue und die QuEChERS Methode nur bei wenigen Analyten. Mit dem neuen Verfahren konnten folglich im Gegensatz zu den etablierten Methoden sowohl unpolare GC- als auch polare LC-Analyten sicher erfasst werden.

Die Rückstandsanalytik tierischer Lebensmittel ist eine anspruchsvolle Aufgabe aufgrund des hohen Lipidanteils der Proben sowie des sich stetig vergrößernden Wirkstoffspektrums. Heutzutage werden für die Probenaufarbeitung die DFG S 19 Methode, mit der vorrangig unpolare Analyten nachgewiesen werden und zunehmend die QuEChERS Methode eingesetzt, die insbesondere auf die Erfassung polarer Pestizide abzielt. In dieser Arbeit wurde eine moderne Multirückstandsmethode für Hühnereier entwickelt, um sowohl gas- als auch flüssigkeitschromatographisch (GC, LC) erfassbare Wirkstoffe zu analysieren. Dazu gehören unpolare PCBs, Pyrethroide und Organochlorpestizide, aber auch polarere Organophosphate, Triazole und Carbamate. Das Verfahren basiert auf der Extraktion mittels Matrix Solid Phase Dispersion, der Reinigung auf Grundlage einer modifizierten Gelpermeationschromatographie (GPC) und zwei verschiedenen Festphasenextraktionen (SPEs) für GC- und LC-erfassbare Pestizide sowie der Quantifizierung mittels GC- und LC-MS/MS. Dünnschichtchromatographisch wurde die effektive Entfernung hochmolekularer Lipide durch die modifizierte GPC und niedrigmolekularer Fette durch die SPEs belegt. Laut der für Ei durchgeführten Validierung erfüllten 164 der 172 untersuchten Pestizide und alle sechs PCBs die Leistungskriterien für die amtliche Rückstandskontrolle - zumeist am niedrigsten validierten Level (5 µg/kg bzw. 0,5 µg/kg). Ausnahmen bildeten sehr polare LC-Pestizide (z.B. Aminopyralid, Clopyralid, MCPA, Quinmerac) und pH-Wert-abhängige GC-Analyten (Nicotin, Tolylfluanid, Dichlofluanid), die auch mit den etablierten Verfahren schwierig zu analysieren sind. Weiterhin verdeutlichte die erfolgreiche Untersuchung von verschiedenen Ringversuchsmaterialien, dass die ursprünglich für Eier entwickelte Methode auch für mageres Geflügelfleisch und Sahne genutzt werden kann. Gegenüber den etablierten Verfahren wies die neue Methode deutliche Vorzüge auf. So belegte die Dünnschichtchromatographie, dass mit der neuen Methode Cholesterin, aber auch freie Fettsäuren besser abgetrennt werden als mit den etablierten Verfahren. Die neue Methode verbrauchte im Vergleich zur DFG S 19 Methode 46 % weniger Lösungsmittel und ermöglichte eine Verdopplung des Probendurchsatzes innerhalb von 8 h. Zudem eignete sich das entwickelte Verfahren laut den Validierungsdaten für GC-Analyten deutlich besser als die QuEChERS Methode und etwas besser als die DFG S 19 Methode (v.a. für Pyrethroide). Hinsichtlich der LC-Analyten unterschieden sich die neue und die QuEChERS Methode nur bei wenigen Analyten. Mit dem neuen Verfahren konnten folglich im Gegensatz zu den etablierten Methoden sowohl unpolare GC- als auch polare LC-Analyten sicher erfasst werden.:1 EINLEITUNG UND ZIELSTELLUNG 1 2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN 3 2.1 Grundlagen der Pestizidanalytik 3 2.1.1 Definitionen 3 2.1.2 Rechtliche Grundlagen in Bezug auf tierische Lebensmittel 3 2.2 Herausforderung der Analytik tierischer Lebensmittel 6 2.2.1 Erfassen eines breiten Analytspektrums 6 2.2.2 Komplexität der tierischen Matrix 8 2.3 Probenaufarbeitung tierischer Lebensmittel 11 2.3.1 Extraktion 11 2.3.2 Möglichkeiten der Lipid-Reinigung 14 2.3.3 Messmethoden in der modernen Pestizidanalytik 18 2.4 Multimethoden in der Pestizidanalytik tierischer Lebensmittel 21 2.4.1 Vorstellung etablierter Multimethoden 21 2.4.2 Vergleich etablierter Multimethoden 24 2.4.3 Forschungsergebnisse bezüglich fetthaltiger Matrizes bis 2010 26 3 ERGEBNISSE 28 3.1 Auswahl relevanter Analyten in tierischen Lebensmitteln 28 3.2 Auswahl der Matrix Hühnerfrischei 30 3.3 Messung mittels GC-MS/MS und LC-MS/MS 32 3.3.1 Ansatz 32 3.3.2 Erstellung einer GC-MS/MS Datenbank 33 3.3.3 Besonderheiten der SRM-Messmethoden 36 3.3.4 Vorsäulen-Backflush in der Gaschromatographie 38 3.3.5 Leistungsfähigkeit der SRM-Methoden 44 3.4 Beurteilung des Reinigungseffektes 45 3.5 Entwicklung der Probenaufarbeitungsmethode 47 3.5.1 Ziele und allgemeines Vorgehen 47 3.5.2 Extraktion mittels Matrix Solid Phase Dispersion 48 3.5.3 Konzentrierung von Lösungsmittelextrakten 55 3.5.4 Lipidentfernung durch Ausfrieren 56 3.5.5 Modifizierung der GPC zur Verbesserung der Wirtschaftlichkeit 57 3.5.6 Festphasenextraktion 63 3.6 Analysemethode für Eier 78 3.7 Validierung der neuen Analysemethode 82 3.7.1 Hintergrund und Durchführung 82 3.7.2 Linearität 83 3.7.3 Spezifität 84 3.7.4 Wiederfindungsraten und Wiederholbarkeit 84 3.7.5 Bestimmungsgrenze 88 3.7.6 Matrix-spezifische Auswirkung auf die Analyten 88 3.8 Vergleich mit etablierten Probenaufarbeitungsmethoden 89 3.8.1 Ansatz 89 3.8.2 Reinigungseffekt 90 3.8.3 Validierungsdaten 93 3.8.4 Identifizierung und Quantifizierung anhand gewachsener Rückstände 95 3.8.5 Zusammenfassende Bewertung 97 3.9 Untersuchung verschiedener Ringversuchsmaterialien 99 4 DISKUSSION 103 4.1 Entwickelte Analysemethode 103 4.2 Ausblick 111 5 ZUSAMMENFASSUNG 113 6 LITERATUR 117 7 ANHANG A-1