Animal models have greatly contributed to the understanding of different aspects of human biology, as well as a variety of human-related pathogens and diseases. In order to study them, humanized mice susceptible to pathogens that replicate in human immune cells have been developed (e.g., humanized Rag2-/-γc-/- mice). These animals are engrafted with human hematopoietic stem cells (HSCs), resulting in the de novo development and maturation of the major functional components of the human adaptive immune system and the production of a variety of human cell types. Primary and secondary lymphoid organs in the mouse are populated with human cells, and animals have long term engraftment. These features make humanized mice an excellent in vivo model to study pathogenesis of human-specific viruses in the context of a human antiviral immune response. In addition, humanized mice have been shown to be useful preclinical models for the development and validation of antiviral therapeutics. In the present study, we aimed to successfully re-establish the humanized Rag2-/-γc-/- mouse model using cord blood-derived HSCs in our laboratory. We have shown that these mice sustain long term engraftment and systemic expansion of human cells, including the major targets of Kaposi's sarcoma Herpesvirus (KSHV) and Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), in peripheral blood and different lymphoid organs. Further, we have begun to evaluate the susceptibility of the humanized Rag2-/-γc-/- mouse model to infection with KSHV. We demonstrate that human lymphocytes differentiated in reconstituted Rag2-/-γc-/- mice are permissive to KSHV infection ex vivo. This finding was corroborated by detection of KSHV mRNA expression in the spleen of a humanized mouse at 6 months post infection. In a different study, we tested the in vivo antiviral efficacy of a novel HIV-1 fusion inhibitor (PIE-12-trimer) in humanized Rag2-/-γc-/- mice. We have determined the half life of PIE-12-trimer in mouse plasma. Furthermore, the administration of PIE-12-trimer to HIV-1 infected humanized Rag2-/-γc-/- mice prevents depletion of CD4+ T cells in blood, thus it may be useful to prevent AIDS in human patients.

In dieser Arbeit wurde die Induktion spezifischer, immunologischer T-Zelltoleranz als therapeutische Strategie bei Autoimmunerkrankungen im Mausmodell untersucht. Da davon ausgegangen werden muss, dass viele der Autoimmunkrankheiten durch T-Zellen vermittelt sind, ist die Induktion spezifischer T-Zelltoleranz eine besonders interessante Therapiestrategie. Spezifische T-Zelltoleranz kann mittels Injektion des entsprechenden Peptidantigens induziert werden. Insgesamt sind zur Induktion einer solchen Toleranz, zumindest beim Menschen, relativ hohe Dosen an Peptidantigen notwendig. Die Produktion dieser Peptidantigene ist teuer. Bei unvorsichtiger Gabe kann es zur Anaphylaxie kommen. Es sollte also von Vorteil sein, die zu applizierende Menge an Peptid möglichst gering, dabei aber effizient zu halten. Vermutlich werden Antigene in Form von Peptiden schnell von unspezifischen Peptidasen und Proteasen in nicht-immunogene Fragmente gespalten und ausgeschieden, was wiederum eine hohe Dosierung erforderlich macht. Im Anfang der vorliegenden Arbeit stand die Hypothese, dass eine Stabilisierung des zu applizierenden Antigens zum Schutz vor Fragmentierung (und damit Wirkungsverlust) eine geeignete Methode sein könnte, Toleranzinduktion effektiver bzw. kostengünstiger zu gestalten. Bezüglich einer Stabilisierung von Peptiden zeigte sich, dass Peptide, welche aus rechtsdrehenden (D-)Aminosäuren zusammengesetzt sind, nur verzögert durch Proteasen/Peptidasen abgebaut werden. Wir setzten deshalb in dieser Arbeit D-Aninosäuren-substituierte Peptid-Varianten des Ovalbumin323-339-Peptidepitops (OVA323-339) ein und betrachteten die Wirkung dieser Peptide in vitro sowie in vivo auf spezifische DO11.10 T-Zellen. Basierend auf dem Peptidantigen OVA323-339, wurde zunächst ein minimales Epitop definiert, welches bei etwa gleicher Potenz um 6 Aminosäuren verkürzt werden konnte. Anschließend wurde eine Substitutionsanalyse durchgeführt, in der die ursprüngliche Aminosäuresequenz durch Austausch einiger L-Aminosäuren mittels D-Aminosäuren verändert wurde. Diese neu synthetisierten Peptide wurden zunächst auf ihre Fähigkeit überprüft, die OVA323-339 spezifischen DO11.10 T-Zellen in vitro zu aktivieren. Parallel konnte gezeigt werden, dass diese synthetisierten Peptidepitope in vitro eine deutlich verlängerte Serumhalbwertszeit aufwiesen. Im Weiteren wurde versucht, durch systemische Injektion von 300µg D-Peptid-Varianten in BABLB/c Mäusen T-Zelltoleranz zu induzieren. Die ex vivo restimulierten Lymphknoten-Zellen dieser Mäuse präsentierten je nach appliziertem Peptid eine reduzierte Proliferationsbereitschaft und IL-2 Sekretion. Die hier induzierte Toleranz konnte bis zu 60 Tagen post injectionem sowohl für das OVA323-339 als auch für einige der eingesetzten D-Peptide nachgewiesen werden. Auch nach Reduktion der Peptiddosis auf nur 100µg/Maus, waren die verkürzten und D-Aminosäuren-substituierten Peptide immer noch in der Lage sicher Toleranz zu induzieren. Die induzierte Toleranz durch D-Peptide war dabei der durch das Ausgangspeptid OVA323-339 induzierten Toleranz vergleichbar stark. Mit der Hilfe eines Transfermodells in unmanipulierte Mäuse, wurde das Verhalten der spezifischen T-Zellpopulation in vivo beobachtet. Durch den Transfer konnten in den Empfängermäusen (Balb/c) definierte T-Zellpopulationen bekannter Größe erzeugt werden. Mit dem Antikörper KJ1-26.1, der spezifisch den DO11.10-T-Zellrezeptor erkennt, konnten die transferierten Zellen in Geweben der Empfängermaus per FACS-Analyse nachgewiesen und deren Verhalten ex vivo studiert werden. Die intravenöse Injektion der serumstabilisierten Peptidanaloge führte in den transferierten Mäusen je nach Peptid zu einer funktionellen Nichtreaktivität (Anergie) als auch zur Deletion der für das Ausgangs(L-)Peptid spezifischen DO11.10 T-Zellen. In den oben genannten Versuchen ergaben sich Hinweise dafür, dass die D-Peptide ebenso effektiv sind wie das wesentlich längere Ausgangspeptid OVA323-339. Zukünftige Experimente werden weitere Aufschlüsse über einen möglichen Vorteil des Einsatzes von D-Peptiden in der Toleranzinduktion erbringen. / Induction of antigen-specific peripheral T cell tolerance in autoimmune diseases is an interesting therapeutically strategy. It can be induced by systemic injection of high-dose antigen. Investigations in induction of peripheral T cell tolerance in autoimmune mouse models revealed promising results. But it was also shown that the induced T cell tolerance spontaneously reverses after a period of time. This is probably due to a short in vivo half-life of the administrated peptide antigens. Since durable tolerance is required for this strategy to be of therapeutic value the administrated antigen-dose has to be of a very high and has to be injected repeatedly, and therefore bears an increased risk of anaphylactic reactions or exacerbation of the autoimmune disease. Because of these restrictions and also the high costs of peptide-production and purification, it is not surprising that this therapy didn t really find its way in to the clinical practice. The discovery that Peptides assembled partly or totally from D-amino acids are much more stable to proteolysis then natural L-peptides and therefore show an increased stability, lead to a wide interest of pharmacologists and immunologists. In former investigations it was shown that D-peptides used as vaccines elicited high levels of neutralizing antibodies so that there is no doubt about their immunogenic potency in vivo. It is also known that a single T cell receptor recognizes a wide range of peptide analogues that closely mimic the natural antigen. These observations led to our hypothesis, that the induction of peripheral T cell tolerance by systemic administration of D-Peptide substituted antigen variants should be possible and could be much more effective than the induction by the wild-type L-peptide. To verify our hypothesis we have chosen the well known OVA323-339 antigen which is recognized by T cells through the presentation in the I-Ad context. In a first step we performed a truncation analysis of OVA323-339 to identify a minimal epitope in it. We were able to demonstrate that the sequence OVA327-337 is as well potent as the original and 6 amino acids longer OVA323-339 sequence. The potency of new defined epitopes was tested by stimulating the OVA323-339 -specific DO11.10 T cells in vitro. In a stepwise performed substitution analysis we attempted to insert some D-amino acids in this novel peptide epitope. The DO11.10 cells only tolerated a few D-amino acid substitutions into the original sequence with the effect of now showing reduced proliferation. Performing an analysis of their half-life in vitro we identified two peptides as interesting candidates for the in vivo tolerance induction experiments. In the in vivo part of this work we induced peripheral tolerance by injecting the novel peptides into BALB/c mice. To monitor the behaviour of the tolerated T cells we also performed adoptive transfer experiments by transferring DO11.10 cells into naive BALB/c mice. With the help of the KJ26-1 antibody which specifically recognizes the DO11.10 T cell receptor it became possible to detect the transferred T cells ex vivo. Our results demonstrate that induction of peripheral T cell tolerance through injection of D-peptides is possible and long lasting (up to 60 days). Even with a dose reduction we found a stable T cell tolerance under ex vivo restimulation with the original peptide. Summarizing we were able to show that D-peptides are at least as effective as the natural occurring L-peptides inducing tolerance. Much more, the transfer experiments revealed that the kind of induced T cell tolerance (i.e. anergy and/or deletion through activation induced cell death) is antigen dependent and probably differs due to the agonistic potency of the given antigen.