Köln, Universiẗat, Diss., 2002.

Düsseldorf, Universiẗat, Diss., 2003.

Universiẗat, Diss., 2005--Würzburg.

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Die Cyclodextrin-modifizierte Kapillarelektrophorese (CE) ist eine wichtige chirale analytische Technik geworden, die zur HPLC und zur Gaschromatographie komplementär ist und sich deshalb für die Analyse der Abbauprodukte von Aspartam gut eignet. Ausgehend von diesen Abbauprodukten wurden im Arbeitskreis Scriba an der Universität Jena systematische Studien über die Trennung von Enantiomeren verschiedener Dipeptide mit einer Vielzahl von nativen und derivatisierten Cyclodextrinen bei verschiedenen pH-Werten durchgeführt. Bei der Trennung der Enantiomere von z. B. Ala-Phe oder Ala-Tyr mit beta-Cyclodextrin wurde eine Umkehr der Migrationsreihenfolge bei Erhöhung des Puffer-pH-Werts von 2,5 auf 3,5 festgestellt. Mit Heptakis-(6-sulfato)-beta-cyclodextrin (HS-beta-CD), Heptakis-(2,3-O-diacetyl)-beta-cyclodextrin (Diac-beta-CD) und Heptakis-(2,3-diacetyl-6-sulfato)-beta-cyclodextrin (HDAS-beta-CD) wurde diese Umkehr der Migrationsreihenfolge nicht beobachtet. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, den Mechanismus der Wechselwirkungen zwischen Cyclodextrinen und Aminosäuren bzw. Dipeptiden gründlich und umfassend zu untersuchen. Dabei ging es v. a. um die Untersuchung der Mechanismen der chiralen Erkennung durch Cyclodextrine, die mit Hilfe von verschiedensten Analysenmethoden, vor allem potentiometrische Titrationen und spektroskopische Methoden, wie der NMR-, UV- und CD-Spektroskopie durchgeführt werden sollten. Damit sollte auch die beobachtete Umkehr der Migrationsreihenfolge bei Erhöhung des pH-Wertes des Laufpuffers in der CE erklärt werden. Die potentiometrische Titrationsmethode lieferte sinnvolle Bindungskonstanten für Cyclodextrin-Einschlusskomplexe mit Aminosäuren. Eine Analyse der Struktur-Aktivitätsbeziehungen für Aminosäuren und Cyclodextrine ergab, dass ein gewisses Volumen der Aminosäure-Seitenkette und damit ein gutes Ausfüllen der Cyclodextrin-Kavität nötig ist, um den vollen Nutzen aus den hydrophoben Wechselwirkungen zwischen der Aminosäure-Seitenkette und der Cyclodextrin-Kavität zu ziehen. Eine Verlängerung des hydrophilen Restes, der aus der Kavität herausragt, wie bei den untersuchten Dipeptiden Ala-Phe und Ala-Tyr der Fall, führt zu der Möglichkeit der Ausbildung von Wasserstoff-Brücken mit den Hydroxylgruppen am breiteren Rand der Cyclodextrin-Kavität und damit zu einer stärkeren Bindung an das Cyclodextrin. Um den chiralen Erkennungsprozess von beta-CD und einigen seiner Derivate, nämlich HS-beta-CD, Diac-beta-CD und HDAS-beta-CD, zu verstehen, wurden NMR-Experimente durchgeführt, und zwar wurden „durch Komplexbildung induzierte Verschiebungen der chemischen Verschiebungen” (complexation induced chemical shifts, CICS) gemessen und mittels ROESY-Experimenten die Komplexgeometrie untersucht. Betrachtet man die CICS, die für die Paare Diac-beta-CD/Ala-Phe, HDAS-beta-CD/Ala-Phe, Diac-beta-CD/Ala-Tyr und HDAS-beta-CD/Ala-Tyr auftreten, dann zeigt sich, dass sie relativ klein sind und demnach auf eine eher schwache Wechselwirkung des jeweiligen Gastmoleküls mit dem Wirt hindeuten. Die CICS für beta-CD- und HS-beta-CD-Dipeptid-Komplexe bestätigten einen Einschluss des aromatischen Restes in die Cyclodextrin-Kavität. Es konnte gezeigt werden, dass bei pH 2.5 das DD-Enantiomer von Ala-Tyr tiefer in die Kavität von beta-CD eintaucht als das LL-Enantiomer. Außerdem ist bei pH 3.5 die Eintauchtiefe in die Kavität geringer als bei pH 2.5, was durch die Ergebnisse der ROESY-Experimente bestätigt werden konnte. Um einen besseren Einblick in die Bindungsmodi der Enantiomere von Ala-Phe und Ala-Tyr mit beta-CD bei unterschiedlichen pH-Werten zu erhalten, wurden Moleküldynamik-(MD-)-Simulationen durchgeführt. Die Simulationen wurden mit jedem Enantiomer von Ala-Phe und Ala-Tyr in jedem möglichen Protonierungszustand durchgeführt, d. h. Kation, Zwitterion und Anion. Zum ersten Mal wurden MD-Simulationen für eine größere Serie von unterschiedlichen Komplexen von Enantiomeren in verschiedenen Protonierungszuständen systematisch über den langen Zeitraum von 1 ns (=1000 ps) ausgeführt. Die Eintauchtiefe der untersuchten Dipeptide wurde mit Hilfe einer in die Cyclodextrin-Kavität eingepassten Ebene berechnet. Auf diese Weise konnten Informationen über das unterschiedliche Einschlussverhalten der untersuchten Dipeptide erhalten werden. Die angewendete Methode lässt sich leicht auf andere Wirt-Gast-Komplexe übertragen und erleichtert die Datenerfassung auch in anderen Fällen. Es konnte gezeigt werden, dass bei pH 2.5 das DD-Enantiomer von Ala-Phe tiefer in die Kavität von beta-Cyclodextrin eintaucht als das LL-Enantiomer, wohingegen bei pH 3.5 der umgekehrte Fall vorliegt. Betrachtet man das Dipeptid Ala-Tyr, dann dringt bei pH 2.5 das DD-Enantiomer tiefer ein, wohingegen keine klare Aussage über das Eindringverhalten der Enantiomere bei pH 3.5 gemacht werden kann. Die CICS und die Ergebnisse der Kapillarelektrophorese weisen jedoch auf ein tieferes Eindringen des LL-Enantiomers hin. / Cyclodextrin-modified capillary electrophoresis (CE) has become an important chiral analytic tool which is complementary to gas chromatography and HPLC. It is applicably for the analysis of polar substances particularly well, and is therefore suitable for the analysis of the degradation products of aspartame. On the basis of these degradation products, systematic studies on the separation of enantiomers of different dipeptides with a variety of native and derivated cyclodextrins at different pH values were accomplished by the group of Scriba at the University of Jena. While increasing the buffer pH value from 2.5 to 3.5, the separation of the enantiomers of Ala-Phe or Ala-Tyr with beta-cyclodextrin revealed a reversal of the migration order. With heptakis-(6-sulfato)-beta-cyclodextrin (HS-beta-CD), heptakis-(2,3-O-diacetyl)-beta-cyclodextrin (Diac-beta-CD) and heptakis-(2,3-diacetyl-6-sulfato)-beta-cyclodextrin (HDAS-beta-CD), this reversal of the migration order was not observed. The goal of this work was to examine the interaction mechanisms between cyclodextrins and amino acids and/or dipeptides. The primary goal was the investigation of the chiral recognition mechanisms of cyclodextrins, which were examined by most diverse analysis methods, e. g. potentiometric titration and NMR spectroscopy as well as UV and CD spectroscopy. In addition, it was aimed to elucidate the reason of the reversed migration order observed with increasing pH value of the running buffer in CE. The potentiometric titration method led to reasonable binding constants for cyclodextrin inclusion complexes with amino acids. An analysis of the structure activity relationship for amino acids and cyclodextrins resulted in the fact that a certain volume of the amino acid side chain and thus a good fit to the cyclodextrin cavity are necessary in order to take full advantage of the hydrophobic interactions between the amino acid side chain and the cyclodextrin cavity. An extension of the hydrophilic moiety, which protrudes out of the cavity, as present with the examined dipeptides Ala-Phe and Ala-Tyr, leads to the possibility of developing hydrogen bonds with the hydrogyl groups at the wider rim of the cyclodextrin cavity and thus to a stronger binding to the cyclodextrin. In order to understand the chiral recognition process of beta-CD and some of its derivatives, i.e. HS-beta-CD, Diac-beta-CD and HDAS-beta-CD, NMR experiments were accomplished, namely “complexation induced chemical shifts” (CICS); and the complex geometry was examined by means of ROESY experiments. Regarding the pairs of Diac-beta-CD/Ala-Phe, HDAS-beta-CD/Ala-Phe, Diac-beta-CD/Ala-Tyr and HDAS-beta-CD/Ala-Tyr, the CICS occured to be relatively small and thus exhibit rather weak interactions of the respective guest molecule with the host. The CICS for beta-CD- and HS-beta-CD-dipeptide complexes confirmed an inclusion of the aromatic moiety into the cyclodextrin cavity. It could be shown that at pH 2.5 the DD enantiomer of Ala-Tyr immerses more deeply into the beta-CD cavity than the LL enantiomer. Additionally, the immersion into the cavity is shallower at pH 3.5 than at pH 2.5, which could be confirmed by the results of the ROESY experiments. In order to receive a better view of the binding modes of the Ala-Phe and Ala-Tyr enantiomers with beta-CD at different pH values, molecular dynamics simulations (MD simulations) were carried out. The simulations were accomplished with each Ala-Phe and Ala-Tyr enantiomer in each possible state of protonation, i.e. cation, zwitterion and anion. For the first time MD simulations for a larger series of different complexes of enantiomers in different states of protonation were implemented systematically during the long period of 1 ns (= 1000 ps). The immersion depth of the examined dipeptide was computed with the help of a plane fit into the cyclodextrin cavity. In this way information about the different inclusion behaviour of the examined dipeptide could be received. The applied method can be transferred easily to other host-guest complexes and facilitates the data acquisition in other cases, too. It could be shown that at pH 2.5, the DD enantiomer of Ala-Phe immerses more deeply into the beta-cyclodextrin cavity than the LL enantiomer, whereas at pH 3.5, the reversal is the case. Regarding the dipeptide Ala-Tyr, at pH 2.5 the DD Enantiomer penetrates the cavity more deeply, whereas no clear statement about the penetration behaviour of the enantiomers can be made at pH 3.5. The CICS and the capillary electrophoresis results refer, however, to a deeper penetration of the cavity by the LL enantiomer.

Staphylococcus aureus is a Gram-positive bacterium and part of the human bacterial microflora but it also is an opportunistic pathogen and a notorious cause of hospital – acquired and epidemic infections. S. aureus shows a remarkable adaptation to a range of niches within its human host.Previously viewed as an exclusively extracellular pathogen, S. aureus has been demonstrated to replicate inside virtually all cell types after cell invasion. S. aureus thereby either multiplies within phagosomal compartments in professional phagocytes or escapes into the cytosol prior to replication in non-professional phagocytic cells such as epithelial cells. Besides α-type phenol soluble modulins(PSMα, an important role in phagosomal escape was attributed to the non-ribosomal peptide synthase (NRPS) AusAB. AusAB incorporates the aromatic amino acids (AAAs) phenylalanine or tyrosine, as well as the branched-chain amino acids (BCAAs) valine and leucine into three cyclic dipeptides collectively called aureusimines: Phevalin, Tyrvalin and Leuvalin. The role of AusAB in S. aureus infection is not entirely understood. BCAAs are essential amino acids for S. aureus and serve as protein building blocks,precursors for the biosynthesis of branched-chain fatty acids, as well as regulatory molecules for the transcriptional regulator CodY. Severe BCAA depletion triggers stringent response. It is therefore counterintuitive that AusAB would incorporate valine into aureusimines thereby depleting BCAAs in host niches where available nutrients are scarce. The present study therefore analysed the role of the AusAB NRPS and its BCAA-derived monoketopiperazine products, in the interaction of S. aureus with various host niches and with other bacterial species. By using genetic tools and metabolomic approaches, it could be established that the AusAB NRPS preferentially incorporates only the exogenous aromatic amino acids phenylalanine and tyrosine, while the source of valine can be either endogenous or exogenous. By using promoter reporter assays, an effect of the global SaeR regulator on ausAB expression was observed. Additionally, a possible role of the NRPS in modulatory metabolic processes of overflow metabolism emerged. Finally, while the role of AusAB in infection is still unclear, experiments using ex vivo human lung tissue suggest, for the first time, that AusAB NRPS might be involved in the staphylococcal virulence against human lung tissue. By employing bioluminescence and biofilm assays in both Gram-negative (Vibrio harveyi and Pseudomonas aeruginosa) and Gram-positive (CoNS Staphylococcus spp.) model species, a potential role as a Quorum Quenching molecule arose for Phevalin, but not Tyrvalin. While studying a potential connection of AusAB and stringent response, an unexpected role for the BrnQ1 BCAA transporter was revealed. BrnQ1 is known as the major BCAA import protein in S. aureus. The bacteria therefore rely on its activity in environments with low concentrations of available peptides or free BCAAs. The present study shows that BrnQ1 is necessary for efficient phagosomal escape of S. aureus in epithelial cells and that BrnQ1-mediated BCAA uptake is crucial for intracellular bacterial replication in epithelial cells, macrophages and whole human blood. Moreover, BrnQ1 loss of function allows bacteria to survive indefinitely inside macrophages without causing phenotypic changes in colony morphology, size and pigmentation as well as haemolysis after recovery. A dual RNA-sequencing approach further showed that, while no major host transcriptomic rearrangements occurred in human macrophages infected with brnQ1 mutants compared to wild-type S. aureus, intracellular brnQ1 mutants do not respond to local host iron depletion and thus fail to upregulate iron uptake systems. In summary, the present work elaborates on multiple functions of BCAA-based small molecules as well as BCAA-transporters in the S. aureus host and bacterial interactions. This work provides a consolidation of the role of the AusAB NRPS in S. aureus lung infection, gives an insight into the unique mode of action of the NRPS and attributes a novel function for the NRPS-product Phevalin in bacterial communication providing, to my knowledge, the first example of a natural monoketopiperazine involved in bacterial communication. Further, experiments using ex vivo human lung tissue suggest, for the first time, that AusAB NRPS might be involved in the staphylococcal virulence against human lung tissue. Additionally, this work describes a potential mechanism of S. aureus long-term survival in macrophages involving a BCAA-iron metabolism axis. / Staphylococcus aureus ist ein Gram-positives Bakterium und Teil der menschlichen bakteriellen Mikroflora, aber auch ein opportunistisches Pathogen und eine allgemein bekannte Ursache für Krankenhaus- und epidemische Infektionen. S. aureus zeigt eine bemerkenswerte Anpassung an eine Reihe von Nischen innerhalb seines menschlichen Wirtes. Früher wurde der Erreger ausschließlich als extrazelluläres Pathogen angesehen. Doch es hat sich gezeigt, dass S. aureus nach einer Zellinvasion in praktisch allen Zelltypen replizieren kann. Dabei vermehrt sich S. aureus in professionellen Phagozyten innerhalb phagosomaler Kompartimente, in nicht-professionellen phagozytischen Zellen wie Epithelzellen entweicht das Bakterium vor der Replikation in das Zytosol. Neben α-Typ Phenollöslichen Modulinen (PSMα) wurde der nicht-ribosomalen Peptidsynthase (NRPS) AusAB eine wichtige Rolle beim phagosomalen Ausbruch zugeschrieben. AusAB baut die aromatischen Aminosäuren (AAAs) Phenylalanin oder Tyrosin, sowie die verzweigtkettigen Aminosäuren (BCAAs) Valin und Leucin zu den drei zyklische Dipeptiden Phevalin, Tyrvalin und Leuvalin zusammen, die unter dem Namen Aureusimine zusammengefasst werden. Die Rolle von AusAB bei der S. aureus-Infektion ist nicht vollständig geklärt. BCAAs sind essentielle Aminosäuren für S. aureus und dienen als Proteinbausteine, Vorstufen für die Biosynthese von verzweigtkettigen Fettsäuren sowie als regulatorische Moleküle für den Transkriptionsregulator CodY. Eine starke BCAA-Depletion löst eine stringente Antwort aus. Es ist daher kontraintuitiv, dass AusAB Valin in Aureusimine einbaut und damit BCAAs in Wirtsnischen, in denen die verfügbaren Nährstoffe knapp sind, dezimiert. In der vorliegenden Studie wurde daher die Rolle der AusAB NRPS und seiner BCAA-abgeleiteten Monoketopiperazin-Produkte bei der Interaktion von S. aureus mit verschiedenen Wirtsnischen und mit anderen Bakterienarten analysiert. Durch den Einsatz von genetischen Werkzeugen und metabolomischen Ansätzen konnte festgestellt werden, dass die AusAB NRPS bevorzugt nur die exogenen aromatischen Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin einbaut, während die Quelle für Valin entweder endogen oder exogen sein kann. Mit Hilfe von Promotor-Reporter-Assays wurde ein Effekt des globalen Regulators SaeR auf die ausAB-Expression beobachtet. Zusätzlich zeigte sich eine mögliche Rolle des NRPS bei modulatorischen Stoffwechselvorgängen des Überlaufmetabolismus. Schließlich, während die Rolle von AusAB bei der Infektion noch unklar ist, deuten Experimente mit ex vivo menschlichem Lungengewebe zum ersten Mal darauf hin, dass das NRPS von AusAB an der Virulenz von Staphylokokken gegenüber menschlichem Lungengewebe beteiligt sein könnte. Durch den Einsatz von Biolumineszenz- und Biofilm-Experimenten bei repräsentativen Gramnegativen (Vibrio harveyi und Pseudomonas aeruginosa) als auch Gram-positiven (CoNS Staphylococcus spp.) Spezies ergab sich für Phevalin, nicht aber für Tyrvalin, eine mögliche Rolle als Quorum Quenching-Molekül. Bei Untersuchung einer möglichen Verbindung von AusAB und der stringenten Antwort wurde eine unerwartete Rolle für den BrnQ1 BCAA-Transporter entdeckt. BrnQ1 ist als das wichtigste BCAAImportprotein in S. aureus bekannt. Die Bakterien sind daher auf seine Aktivität in Umgebungen mit niedrigen Konzentrationen an verfügbaren Peptiden oder freien BCAAs angewiesen. Die vorliegende Studie zeigt, dass BrnQ1 für einen effizienten phagosomalen Ausbruch von S. aureus in Epithelzellen notwendig ist und dass die BrnQ1-vermittelte BCAA-Aufnahme für die intrazelluläre bakterielle Replikation in Epithelzellen, Makrophagen und menschlichem Vollblut entscheidend ist. Darüber hinaus ermöglicht der Funktionsverlust von BrnQ1 den Bakterien ein unbegrenztes Überleben im Inneren von Makrophagen ohne phänotypische Veränderungen in Koloniemorphologie, -größe und -pigmentierung sowie in Hämolyse nach der Rückgewinnung der Bakterien. Ein dualer RNASequenzierungsansatz zeigte darüber hinaus, dass in humanen Makrophagen, die mit brnQ1- Mutanten infiziert waren, im Vergleich zu Wildtyp S. aureus keine größeren Transkriptomänderungen im Wirt auftraten. Jedoch reagierten intrazelluläre brnQ1-Mutanten nicht auf eine lokale Eisenverarmung des Wirts und regulieren somit keine Eisenaufnahmesysteme hoch. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit die vielfältigen Funktionen von BCAA-basierten kleinen Molekülen sowie von BCAA-Transportern in der Interaktion zwischen dem S. aureus-Wirt und -Bakterium auf. Diese Arbeit liefert eine Konsolidierung der Rolle des AusAB NRPS in der S. aureus Lungeninfektion, gibt einen Einblick in die einzigartige Wirkweise des NRPS und schreibt dem NRPSProdukt Phevalin eine neuartige Funktion in der bakteriellen Kommunikation zu, die meines Wissens das erste Beispiel eines an der bakteriellen Kommunikation beteiligten natürlichen Monoketopiperazins darstellt. Darüber hinaus deuten Experimente mit ex vivo menschlichem Lungengewebe zum ersten Mal darauf hin, dass das AusAB NRPS an der Virulenz von Staphylokokken gegenüber menschlichem Lungengewebe beteiligt sein könnte. Zusätzlich beschreibt diese Arbeit einen möglichen Mechanismus für das Langzeitüberleben von S. aureus in Makrophagen, der eine BCAA-Eisenmetabolismus-Achse beinhaltet.

In this study, M06-2X/6-311+G(2d,2p) level calculations were performed to examine the binding energies and vibrational frequencies of different conformers of phenylalanine dipeptide interacting with metal ions (Na+, K+, Mg2+ and Ca2+). Four conformers were selected from the list of 20 most stable structures. The main goal was to understand the influence of conformers on the binding affinity of metal ions with different conformers of phenylalanine dipeptide. In agreement with experimental results, interactions of metal ions with two aromatic rings along with lone pair electrons of oxygen produced high stability. Binding energy was lowest for the metal ion interacting with only one aromatic ring. This study revealed the binding affinity order of metal ions Mg2+ > Ca2+ > Na+ > K+ with any of the conformers considered for phenylalanine dipeptide.

Universiẗat, Diss., 2003--Dortmund.

Under specific conditions short peptides modified with an N-terminal fluorenyl-9-methoxycarbonyl (Fmoc) group can self-assemble into hydrogel scaffolds similar in properties to the natural extracellular matrix. Fmoc-diphenylalanine (Fmoc-FF) for instance, has been shown to form hydrogels at physiological pH that have the ability to support 2D and 3D cell culture. The aim of this investigation is to provide further understanding of the self-assembly mechanism of such systems in order to progress towards the establishment of design rules for the preparation of scaffolds with tuneable properties.First, Fmoc-dipeptides composed of a combination of hydrophobic aromatic residues phenylalanine (F) and glycine (G) were studied with a particular emphasis on the effect of pH variations. The systems were investigated in order to assess what influence the position of such residues in the peptide sequence had on the physical properties of the molecules, and what impact the chemical structure had on the self-assembly behaviour and the gelation properties of the materials. Subsequently, phenylalanine was replaced by leucine (L), a non-aromatic amino acid that had the same relative hydrophobicity in order to determine whether the self-assembly of such molecules is driven by aromatic interactions or hydrophobic effects.Using potentiometry, the behaviour of the systems in solution has been investigated, revealing that they were all characterised by pKa shifts of up to six units above the theoretical values. Fmoc-FF exhibited two transitions whereas the other Fmoc-dipeptides only displayed one. These transitions were found to coincide with the formation of distinct self-assembled structures with differing molecular conformations and properties that were characterised using transmission electron microscopy, infrared and fluorescence spectroscopy, X-ray scattering and shear rheometry.π-stacking of the aromatic moieties was thought to be the driving force of the self-assembly mechanism, generating dimers that corresponded to the building blocks of the supramolecular structures formed. On the other hand, the peptide components were stabilised via hydrogen bonding and could form antiparallel β-sheets depending on the amino acid sequence and the associated influence on the rigidity of the molecules. Below their (first) apparent pKa transition, Fmoc-FF, Fmoc-LL, Fmoc-FG, Fmoc-LG and Fmoc-GG formed hydrogels, with the mechanical properties and stability varying depending on the amino acid sequence. Fmoc-FF and Fmoc-LL exhibited the lowest storage modulus values (G′ ~ 0.5–5 Pa) of the studied systems while Fmoc-LG displayed the highest (G′ ~ 1000–2100 Pa). Fmoc-FG and Fmoc-LG had the peculiarity of being obtained upon heating and where found to be particularly stable, as opposed to Fmoc-GG gels which showed a tendency to crystallise. On the microscopic scale, these gels were all associated with the presence of entangled fibrillar networks of different size and morphology, which in some cases could self-assemble further through a lamellar organisation. Again, Fmoc-FG and Fmoc-LG distinguished from the other systems as they were the only Fmoc-dipeptides to show a supramolecular chirality in the form of twisted ribbons under specific pH conditions. In contrast, Fmoc-GF and Fmoc-GL did not form hydrogels below their apparent pKa due to the formation of sheet-like and spherical structures respectively.