The genetic diseases Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) and restrictive dermopathy (RD) arise from accumulation of farnesylated prelamin A because of defects in the lamin A maturation pathway. Both of these diseases exhibit symptoms that can be viewed as accelerated aging. The mechanism by which accumulation of farnesylated prelamin A leads to these accelerated aging phenotypes is not understood. Here we present evidence that in HGPS and RD fibroblasts, DNA damage checkpoints are persistently activated because of the compromise in genomic integrity. Inactivation of checkpoint kinases Ataxia-telangiectasia-mutated (ATM) and ATR (ATM- and Rad3-related) in these patient cells can partially overcome their early replication arrest. Treatment of patient cells with a protein farnesyltransferase inhibitor (FTI) did not result in reduction of DNA double-strand breaks and damage checkpoint signaling, although the treatment significantly reversed the aberrant shape of their nuclei. This suggests that DNA damage accumulation and aberrant nuclear morphology are independent phenotypes arising from prelamin A accumulation in these progeroid syndromes. Since DNA damage accumulation is an important contributor to the symptoms of HGPS, our results call into question the possibility of treatment of HGPS with FTIs alone.

The genome of mammalian cells is under constant attack from DNA-damaging agents. To maintain genomic integrity, cells activate an array of pathways primarily consisting of DNA repair and DNA damage checkpoints. Human replication protein A (RPA), a single-stranded DNA (ssDNA) binding protein, is essential for almost all DNA metabolic pathways. However, the role of RPA in nucleotide excision repair (NER), a DNA repair pathway for removing bulky DNA lesions, remains elusive. In this study, the binding of RPA to a battery of well-defined ssDNA substrates has been systematically examined using fluorescence spectroscopy. The results showed that RPA has a lower binding affinity for damaged ssDNA than for non-damaged ssDNA, and there was no direct contact between RPA residues and the lesion itself. These findings will help define the roles of RPA in DNA damage recognition in NER. In cells, RPA undergoes hyperphosphorylation in the N-terminus of RPA32 subunit after DNA damage. In this study, the hyperphosphorylation-induced conformational changes of RPA have been probed using mass spectrometry-based protein foot-printing, fluorescence spectroscopy and limited proteolysis. The data show that upon hyperphosphorylation RPA undergoes a subtle structural change involving its DNA-binding domain B (DBD-B), reducing its affinity for short ssDNA. These results suggest that hyperphosphorylation may modulate RPA functions by altering DBD-B-mediated RPA-DNA/protein interactions. Cellular accumulation of DNA damage has been widely implicated in premature aging. In Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) and restrictive dermopathy (RD), premature aging is caused by defective maturation of lamin A and linked to accumulation of DNA double-strand breaks (DSBs). However, how lamin A dysfunction leads to genome instability and premature aging is not understood. Here evidence showed that in HGPS and RD fibroblasts DNA damage checkpoints are persistently activated and recruitment of repair factors to DSBs was impaired. Strikingly, xeroderma pigmentosum group A (XPA), a unique NER protein, formed foci and colocalized with the unrepairable DSBs in the patient cells. RNAi knockdown of XPA in HGPS cells significantly restored DSB repair. These results indicate that XPA dysfunction may play an important role in accumulating DSBs in HGPS, implicating a potential strategy for treatment of these premature aging diseases.

A quimiorresistência de tumores constitui um dos maiores obstáculos que levam comumente ao fracasso da terapia. Os mecanismos relevantes que contribuem para a resistência celular incluem: bombas de efluxo; alterações na interação entre a droga e o seu alvo e mudanças nas respostas celulares, em particular uma habilidade aumentada de reparar os danos induzidos no DNA e defeitos nas vias apoptóticas. A capacidade de reparar os danos no DNA e a evasão da apoptose são de grande importância, uma vez que a maioria dos quimioterápicos tem sua ação baseada na indução de citotoxicidade pela capacidade de gerar lesões no DNA. Desta forma, uma importante estratégia para melhorar a quimioterapia é o desenvolvimento de abordagens mais seletivas e mecanismos que contornem a resistência tumoral. Neste trabalho, através de um estudo sobre os genes e suas respectivas vias envolvidas no reparo, capacidade de sobrevivência e sinalização de danos induzidos pela nimustina (ACNU) - um agente cloroetilante comumente utilizado em tratamentos quimioterápicos de tumores sólidos - identificamos genes potencialmente alvos para uma terapia adjuvante. Demonstramos que células de glioma p53mt tem menor capacidade de reparo de ICLs induzidos por esta droga do que células p53wt. Também, que a via de NHEJ (\'\'Non Homologous End Joining\'\') não é uma via preferencial de reparo dessas lesões, mas que a via de NER (\'\'Nucleotide Excision Repair\'\') (ou especificamente os produtos gênicos XPA, XPC e XPF) é bastante importante. Curiosamente, na ausência de XPA, NHEJ assume uma participação no reparo dessas lesões, provavelmente devido a um aumento no número de DSBs e saturação das outras vias de reparo. Da mesma forma, verificamos que a DNA polimerase POLH (XPV), envolvida em TLS (\'\'Translesion Synthesis\'\'), também participa na tolerância dessas lesões. Neste contexto, encontramos evidências de que a polimerase TLS (especificamente POLH e POLK) apresentam-se superexpressas em amostras de gliomas, podendo desta forma concorrerem tanto para a tumorigênese quanto para a resistência observada nestes tipos tumorais. Por fim, realizamos o silenciamento gênico através da teconologia de RNAi, que reprimem os genes pela eliminação do transcrito mRNA correspondente, prevenindo a síntese protéica. Os genes-alvo escolhidos para o silenciamento foram, desta forma, XPC, XPF, POLH e POLK. O silenciamento gênico de XPC, XPF e POLH demonstraram-se capazes de sensibilizar significativamente células de glioma, permitindo-nos sugerir estas proteínas como elementos importantes na quimioresistência de gliomas ao ACNU e colocando a inibição dessas moléculas como uma estratégia importante na sensibilização de gliomas ao ACNU e potencialmente a outros agentes quimioterápicos com o mesmo mecanismo de ação. / The chemoresistance of tumors is one of the most important obstacles that commonly lead to the failure of therapy. The main mechanisms that contribute to cellular resistance include efflux pumps; changes in the interaction between the drug and its target and changes in cellular responses, in particular an increased ability to repair induced DNA damages and defects in apoptotic pathways. The ability to repair DNA damage and evasion of apoptosis are of great importance, since most chemotherapy has its action based on the induction of cytotoxicity by the ability to generate DNA lesions. Thus, an important strategy for improving chemotherapy is the development of more selective mechanisms that circumvent tumor resistance approaches. In this work, through a study of genes and pathways involved in the repair, survival and damage signaling induced by nimustine (ACNU) - a cloroethylating agent commonly used in treatments of solid tumors - we aimed to identify target genes for a potentially adjuvant therapy. We demonstrated that glioma cells p53mt have less ability to repair ICLs induced by this drug then p53wt cells. Also, that the NHEJ (\'\'Non Homologous End Joining\'\') pathway is not the main route of repair of these lesions, but that the NER (\'\'Nucleotide Excision Repair\'\') pathway (or specifically the gene products XPA, XPC and XPF) is very important. Interestingly, in the absence of XPA, NHEJ takes place in the repair of those lesions, probably due to an increase in the number of DSBs and saturation of other repair pathways. Likewise, we found that DNA polimerase involved in TLS (\'\'Translesion Synthesis\'\') POLH (XPV) also participates in tolerance of such lesions. We also found evidence that TLS polimerases (specifically POLH and POLK) are overexpressed in gliomas samples and could play a role in the tumorigenesis and in the resistance observed in these tumor types. Finally, we performed gene silencing through RNAi teconology, which repress genes by eliminating the corresponding mRNA transcript, preventing protein synthesis. The target genes selected for silencing were XPC, XPF, POLH and POLK. The knockdown of XPC, XPF and POLH proved to significantly sensitize glioma cells, suggesting these proteins as important elements in the chemoresistance of gliomas and highlighting the inhibition of these molecules as an important strategy in the sensitization of gliomas to ACNU and probably to other chemotherapeutic agents with the same mechanisms of action.

A quimiorresistência de tumores constitui um dos maiores obstáculos que levam comumente ao fracasso da terapia. Os mecanismos relevantes que contribuem para a resistência celular incluem: bombas de efluxo; alterações na interação entre a droga e o seu alvo e mudanças nas respostas celulares, em particular uma habilidade aumentada de reparar os danos induzidos no DNA e defeitos nas vias apoptóticas. A capacidade de reparar os danos no DNA e a evasão da apoptose são de grande importância, uma vez que a maioria dos quimioterápicos tem sua ação baseada na indução de citotoxicidade pela capacidade de gerar lesões no DNA. Desta forma, uma importante estratégia para melhorar a quimioterapia é o desenvolvimento de abordagens mais seletivas e mecanismos que contornem a resistência tumoral. Neste trabalho, através de um estudo sobre os genes e suas respectivas vias envolvidas no reparo, capacidade de sobrevivência e sinalização de danos induzidos pela nimustina (ACNU) - um agente cloroetilante comumente utilizado em tratamentos quimioterápicos de tumores sólidos - identificamos genes potencialmente alvos para uma terapia adjuvante. Demonstramos que células de glioma p53mt tem menor capacidade de reparo de ICLs induzidos por esta droga do que células p53wt. Também, que a via de NHEJ (\'\'Non Homologous End Joining\'\') não é uma via preferencial de reparo dessas lesões, mas que a via de NER (\'\'Nucleotide Excision Repair\'\') (ou especificamente os produtos gênicos XPA, XPC e XPF) é bastante importante. Curiosamente, na ausência de XPA, NHEJ assume uma participação no reparo dessas lesões, provavelmente devido a um aumento no número de DSBs e saturação das outras vias de reparo. Da mesma forma, verificamos que a DNA polimerase POLH (XPV), envolvida em TLS (\'\'Translesion Synthesis\'\'), também participa na tolerância dessas lesões. Neste contexto, encontramos evidências de que a polimerase TLS (especificamente POLH e POLK) apresentam-se superexpressas em amostras de gliomas, podendo desta forma concorrerem tanto para a tumorigênese quanto para a resistência observada nestes tipos tumorais. Por fim, realizamos o silenciamento gênico através da teconologia de RNAi, que reprimem os genes pela eliminação do transcrito mRNA correspondente, prevenindo a síntese protéica. Os genes-alvo escolhidos para o silenciamento foram, desta forma, XPC, XPF, POLH e POLK. O silenciamento gênico de XPC, XPF e POLH demonstraram-se capazes de sensibilizar significativamente células de glioma, permitindo-nos sugerir estas proteínas como elementos importantes na quimioresistência de gliomas ao ACNU e colocando a inibição dessas moléculas como uma estratégia importante na sensibilização de gliomas ao ACNU e potencialmente a outros agentes quimioterápicos com o mesmo mecanismo de ação. / The chemoresistance of tumors is one of the most important obstacles that commonly lead to the failure of therapy. The main mechanisms that contribute to cellular resistance include efflux pumps; changes in the interaction between the drug and its target and changes in cellular responses, in particular an increased ability to repair induced DNA damages and defects in apoptotic pathways. The ability to repair DNA damage and evasion of apoptosis are of great importance, since most chemotherapy has its action based on the induction of cytotoxicity by the ability to generate DNA lesions. Thus, an important strategy for improving chemotherapy is the development of more selective mechanisms that circumvent tumor resistance approaches. In this work, through a study of genes and pathways involved in the repair, survival and damage signaling induced by nimustine (ACNU) - a cloroethylating agent commonly used in treatments of solid tumors - we aimed to identify target genes for a potentially adjuvant therapy. We demonstrated that glioma cells p53mt have less ability to repair ICLs induced by this drug then p53wt cells. Also, that the NHEJ (\'\'Non Homologous End Joining\'\') pathway is not the main route of repair of these lesions, but that the NER (\'\'Nucleotide Excision Repair\'\') pathway (or specifically the gene products XPA, XPC and XPF) is very important. Interestingly, in the absence of XPA, NHEJ takes place in the repair of those lesions, probably due to an increase in the number of DSBs and saturation of other repair pathways. Likewise, we found that DNA polimerase involved in TLS (\'\'Translesion Synthesis\'\') POLH (XPV) also participates in tolerance of such lesions. We also found evidence that TLS polimerases (specifically POLH and POLK) are overexpressed in gliomas samples and could play a role in the tumorigenesis and in the resistance observed in these tumor types. Finally, we performed gene silencing through RNAi teconology, which repress genes by eliminating the corresponding mRNA transcript, preventing protein synthesis. The target genes selected for silencing were XPC, XPF, POLH and POLK. The knockdown of XPC, XPF and POLH proved to significantly sensitize glioma cells, suggesting these proteins as important elements in the chemoresistance of gliomas and highlighting the inhibition of these molecules as an important strategy in the sensitization of gliomas to ACNU and probably to other chemotherapeutic agents with the same mechanisms of action.

Human replication protein A (RPA) is an eukaryotic single-stranded DNA binding protein directly involved in a variety of DNA metabolic pathways including replication, recombination, DNA damage checkpoints and signaling, as well as all DNA repair pathways. This project presents 2 novel roles of RPA in the cellular response to DNA damage. The first elucidates the regulation of RPA and p53 interaction by DNA-dependent protein kinase (DNA-PK), ataxia telangiectasia mutated (ATM) and ATM- and Rad3-related (ATR) in homologous recombination (HR). HR and nonhomologous end joining (NHEJ) are 2 distinct DNA double-stranded break (DSB) repair pathways. Here, we report that DNA-PK, the core component of NHEJ, partners with DNA-damage checkpoint kinases ATM, and ATR to synergistically regulate HR repair of DSBs. The regulation was accomplished through modulation of the p53-RPA interaction. We show that upon DNA damage p53 and RPA are freed from the p53–RPA complex. This is done through simultaneous phosphorylation of RPA by DNA-PK, and p53 by ATR and ATM. Neither the phosphorylation of RPA nor that of p53 alone could dissociate the p53-RPA complex; furthermore, disruption of the release significantly compromised HR repair of DSBs. Our results reveal a mechanism for the crosstalk between HR and NHEJ repair through the coregulation of p53–RPA interaction by DNA-PK, ATM and ATR. The second part of this project reveals a novel role of RPA32 phosphorylation in suppressing the signaling of programmed cell death, also known as apoptosis. Our results show that deficiency in RPA32 phosphorylation leads to increased apoptosis after genotoxic stress. Specifically, PARP-1 cleavage, Caspase-3 activation, sub-G1 cell population, annexin V staining and the loss of mitochondrial membrane potential were significantly increased in the phospho-deficient RPA32 cells (PD-RPA32). The lack of RPA phosphorylation also promoted activation of initiator Caspase-9 and effector Caspase-3 and -7. This regulation is dependent on the kinase activity of DNA-PK and is mediated by PUMA through the ATM-p53 pathway. Our results suggest a novel role of RPA phosphorylation in apoptosis that illuminates a new target that lies on the crossroads of DNA repair and cell death, a pivotal point that could be of importance for sensitizing cancer cells to chemotherapy.

A proteína APE1 (do inglêsApurinic/Apyrimidinicendonuclease 1/ Redox Factor-1 - APE1/REF-1) é uma enzima multifuncional, cuja expressão encontra-se frequentemente aumentada em gliomas. Além de apresentar atividade no reparo por excisão de base (BER), o gene APE1 também atua como fator de redução, mantendo fatores de transcrição (FTs) em um estado reduzido ativo. A via BER de reparo do DNA tem sido apontada como um possível fator de resistência a terapias baseadas no uso de agentes alquilantes, tais como temozolomida (TMZ). No presente trabalho, utilizou-se a estratégia de inibição da transcrição do gene APE1 pelo método de RNA interferente(siRNA) e tratamento com a droga TMZ nas células de glioblastoma (GBM), T98G (resistente à TMZ) e U87MG (sensível à TMZ), a fim de verificar a influência do silenciamento do gene APE1 sobre as respostas celulares à droga avaliadas por vários ensaios, bem como os efeitos sobre a expressão transcricional dos genes alvos dos FTs regulados por APE1. O silenciamento de APE1 e o tratamento das células T98G com a TMZ foram eficazes no sentido de reduzir a proliferação e a capacidade clonogênica, além de intervir na progressão do ciclo celular com bloqueio na fase S. Tais efeitos foram acompanhados pelo aumento da indução de danos no DNA e da expressão de H2AX fosforilada (H2AX), o que justifica a queda na sobrevivência celular. O mesmo efeito não foi observado nas células U87MG silenciadas para APE1 e tratadas com a TMZ, havendo o predomínio dos efeitos causados pela TMZ, exceto por uma leve indução de danos no DNA e de H2AX. Adicionalmente, nas células T98G silenciadas e tratadas, verificou-se uma moderada indução de apoptose, que foi observada ao longo dos tempos avaliados (1 a 10 dias), com uma leve indução de caspase-3 (5 dias); nessas células, observou-se também a indução (3,8 vezes) de morte celular autofágica (5 dias). Entretanto, nas células U87MG,a indução de apoptose foi baixa e não houve indução de morte por autofagia, sugerindo outros mecanismos de morte envolvidos na eliminação dessas células em resposta ao tratamento com a TMZ. O silenciamento de APE1 causou uma redução acentuada na invasão das células T98G, de forma similar à observada nas células somente tratadas com a TMZ, sendo que a combinação (silenciamento de APE1 e tratamento com a droga) resultou em um efeito aditivo, enquanto que nas células U87MG a combinação foi eficaz no sentido de reduzir a proporção de células invasivas, fato não observado nas condições isoladas. Os genes COX2 e VEGF, alvos dos FT NFB e HIF-1 (regulados por APE1) foram reprimidos nas células T98G enquanto que o gene VEGF foi induzido nas células U87MG, entretanto, tais alterações no padrão de expressão transcricional foram observadas somente em resposta ao tratamento com a TMZ, independentemente do silenciamento de APE1, indicando nenhuma mudança na atividade redox de APE1, possivelmente pela existência de proteínas APE1 remanescentes na célula. Além disso, a expressão proteica de NFBp65(ser563) foi aumentada em ambas as linhagens silenciadas e tratadas com a TMZ, provavelmente devido à inibição da proliferação celular. Em geral, os resultados do presente trabalho demonstraram que a estratégia de inibição do gene APE1 (participante da via BER) mostrou-se potencialmente viável, suportando a contribuição do BER na resistência à TMZ, visto que nas condições testadas, observou-se uma sensibilização das células de GBM, com efeito restrito às células de GBM resistentes (linhagem T98G), sendo pouco eficaz no sentido de sensibilizar as células sensíveis (linhagem U87MG) a esse agente. Assim, há que considerar as características genéticas de cada linhagem de GBM, visto que estas são cruciais para as respostas apresentadas pelas células aos tratamentos empregados. / APE1 (Apurinic/Apyrimidinic endonuclease 1/ Redox Factor-1 - APE1/REF-1) protein is a multifunctional enzyme whose expression is often increased in gliomas. Besides presenting activity in base excision repair (BER), APE1 also acts as a reduction factor, maintaining transcription factors (TFs) in an active reduced state. The BER pathway has been implicated as a possible factor of resistance to therapies based on the use of alkylating agents such as temozolomide (TMZ). In the present study, we have been using a strategy of small interference RNA (siRNA) to down-regulate the APE1 gene under conditions of treatment with TMZ in T98G (resistant to TMZ) and U87MG (sensitive to TMZ), glioblastoma (GBM), in order to determine the effects of APE1 gene silencing on cellular responses to this drug, evaluated by several assays, as well as the effects on the transcriptional expression of target genes of TFs regulated by APE1. APE1 silencing and TMZ treatment was effective to reduce the cell proliferation and clonogenic capacity of T98G cells, in addition to interfering in the cell cycle progression (S-phase arrest). These effects were accompanied by induction of DNA damage and phosphorylation of H2AX (H2AX), which may explain the decrease in cell survival. The same effect was not observed in silenced U87MG and TMZ-treated cells, being observed a predominance of the effects caused by TMZ itself, except for a slight induction of DNA damage and H2AX. Additionally, in silenced T98G and TMZ-treated cells, there was a moderate induction of apoptosis, as observed over time (1 to 10 days), with a slight induction of caspase-3 (on day 5); for those cells, we also observed autophagic induction (3.8 fold) at day 5. However, the induction of apoptosis and autophagy in U87MG cells was very low, suggesting that other mechanisms of cell death might be involved in the elimination of GBM cells under TMZ treatment. APE1 silencing caused a marked reduction on the invasiveness of T98G cells, similarly to that observed in TMZ treated cells, while the combination (APE1 silencing and drug treatment) led to an additive effect. For U87MG, the treatment combination was effective in reducing the proportion of invasive cells, in spite of an absence of any effect produced by each isolated condition tested. Regarding to the expression profile of target genes of TFs regulated by the APE1 redox activity, it was observed that COX2 and VEGF genes, targets of FTs NFB and HIF-1, were down-regulated in T98G while VEGF gene showed induced in U87MG cells; however, such alterations in the transcriptional expression pattern were observed only in response to TMZ treatment, independently of APE1 gene silencing, indicating no change in the APE1 redox activity, possibly due to the presence of APE1 remaining proteins inside cells. In addition, NFBp65(ser563) protein expression was increased in both cell lines (silenced and treated with TMZ), probably due to the reduced cell proliferation rates. In general, the present results show that the strategy of APE1 gene knockdown was potentially viable, supporting the BER contribution of the mechanism of TMZ resistance, since under the conditions tested, there was a sensitization of GBM cells. However, this effect was restricted to the resistant cell line (T98G cells). Thus, it should be considered the genetic characteristics of each GBM cell line, since these are crucial to the cellular responses to the conditions tested in the present work.

A proteína APE1 (do inglêsApurinic/Apyrimidinicendonuclease 1/ Redox Factor-1 - APE1/REF-1) é uma enzima multifuncional, cuja expressão encontra-se frequentemente aumentada em gliomas. Além de apresentar atividade no reparo por excisão de base (BER), o gene APE1 também atua como fator de redução, mantendo fatores de transcrição (FTs) em um estado reduzido ativo. A via BER de reparo do DNA tem sido apontada como um possível fator de resistência a terapias baseadas no uso de agentes alquilantes, tais como temozolomida (TMZ). No presente trabalho, utilizou-se a estratégia de inibição da transcrição do gene APE1 pelo método de RNA interferente(siRNA) e tratamento com a droga TMZ nas células de glioblastoma (GBM), T98G (resistente à TMZ) e U87MG (sensível à TMZ), a fim de verificar a influência do silenciamento do gene APE1 sobre as respostas celulares à droga avaliadas por vários ensaios, bem como os efeitos sobre a expressão transcricional dos genes alvos dos FTs regulados por APE1. O silenciamento de APE1 e o tratamento das células T98G com a TMZ foram eficazes no sentido de reduzir a proliferação e a capacidade clonogênica, além de intervir na progressão do ciclo celular com bloqueio na fase S. Tais efeitos foram acompanhados pelo aumento da indução de danos no DNA e da expressão de H2AX fosforilada (H2AX), o que justifica a queda na sobrevivência celular. O mesmo efeito não foi observado nas células U87MG silenciadas para APE1 e tratadas com a TMZ, havendo o predomínio dos efeitos causados pela TMZ, exceto por uma leve indução de danos no DNA e de H2AX. Adicionalmente, nas células T98G silenciadas e tratadas, verificou-se uma moderada indução de apoptose, que foi observada ao longo dos tempos avaliados (1 a 10 dias), com uma leve indução de caspase-3 (5 dias); nessas células, observou-se também a indução (3,8 vezes) de morte celular autofágica (5 dias). Entretanto, nas células U87MG,a indução de apoptose foi baixa e não houve indução de morte por autofagia, sugerindo outros mecanismos de morte envolvidos na eliminação dessas células em resposta ao tratamento com a TMZ. O silenciamento de APE1 causou uma redução acentuada na invasão das células T98G, de forma similar à observada nas células somente tratadas com a TMZ, sendo que a combinação (silenciamento de APE1 e tratamento com a droga) resultou em um efeito aditivo, enquanto que nas células U87MG a combinação foi eficaz no sentido de reduzir a proporção de células invasivas, fato não observado nas condições isoladas. Os genes COX2 e VEGF, alvos dos FT NFB e HIF-1 (regulados por APE1) foram reprimidos nas células T98G enquanto que o gene VEGF foi induzido nas células U87MG, entretanto, tais alterações no padrão de expressão transcricional foram observadas somente em resposta ao tratamento com a TMZ, independentemente do silenciamento de APE1, indicando nenhuma mudança na atividade redox de APE1, possivelmente pela existência de proteínas APE1 remanescentes na célula. Além disso, a expressão proteica de NFBp65(ser563) foi aumentada em ambas as linhagens silenciadas e tratadas com a TMZ, provavelmente devido à inibição da proliferação celular. Em geral, os resultados do presente trabalho demonstraram que a estratégia de inibição do gene APE1 (participante da via BER) mostrou-se potencialmente viável, suportando a contribuição do BER na resistência à TMZ, visto que nas condições testadas, observou-se uma sensibilização das células de GBM, com efeito restrito às células de GBM resistentes (linhagem T98G), sendo pouco eficaz no sentido de sensibilizar as células sensíveis (linhagem U87MG) a esse agente. Assim, há que considerar as características genéticas de cada linhagem de GBM, visto que estas são cruciais para as respostas apresentadas pelas células aos tratamentos empregados. / APE1 (Apurinic/Apyrimidinic endonuclease 1/ Redox Factor-1 - APE1/REF-1) protein is a multifunctional enzyme whose expression is often increased in gliomas. Besides presenting activity in base excision repair (BER), APE1 also acts as a reduction factor, maintaining transcription factors (TFs) in an active reduced state. The BER pathway has been implicated as a possible factor of resistance to therapies based on the use of alkylating agents such as temozolomide (TMZ). In the present study, we have been using a strategy of small interference RNA (siRNA) to down-regulate the APE1 gene under conditions of treatment with TMZ in T98G (resistant to TMZ) and U87MG (sensitive to TMZ), glioblastoma (GBM), in order to determine the effects of APE1 gene silencing on cellular responses to this drug, evaluated by several assays, as well as the effects on the transcriptional expression of target genes of TFs regulated by APE1. APE1 silencing and TMZ treatment was effective to reduce the cell proliferation and clonogenic capacity of T98G cells, in addition to interfering in the cell cycle progression (S-phase arrest). These effects were accompanied by induction of DNA damage and phosphorylation of H2AX (H2AX), which may explain the decrease in cell survival. The same effect was not observed in silenced U87MG and TMZ-treated cells, being observed a predominance of the effects caused by TMZ itself, except for a slight induction of DNA damage and H2AX. Additionally, in silenced T98G and TMZ-treated cells, there was a moderate induction of apoptosis, as observed over time (1 to 10 days), with a slight induction of caspase-3 (on day 5); for those cells, we also observed autophagic induction (3.8 fold) at day 5. However, the induction of apoptosis and autophagy in U87MG cells was very low, suggesting that other mechanisms of cell death might be involved in the elimination of GBM cells under TMZ treatment. APE1 silencing caused a marked reduction on the invasiveness of T98G cells, similarly to that observed in TMZ treated cells, while the combination (APE1 silencing and drug treatment) led to an additive effect. For U87MG, the treatment combination was effective in reducing the proportion of invasive cells, in spite of an absence of any effect produced by each isolated condition tested. Regarding to the expression profile of target genes of TFs regulated by the APE1 redox activity, it was observed that COX2 and VEGF genes, targets of FTs NFB and HIF-1, were down-regulated in T98G while VEGF gene showed induced in U87MG cells; however, such alterations in the transcriptional expression pattern were observed only in response to TMZ treatment, independently of APE1 gene silencing, indicating no change in the APE1 redox activity, possibly due to the presence of APE1 remaining proteins inside cells. In addition, NFBp65(ser563) protein expression was increased in both cell lines (silenced and treated with TMZ), probably due to the reduced cell proliferation rates. In general, the present results show that the strategy of APE1 gene knockdown was potentially viable, supporting the BER contribution of the mechanism of TMZ resistance, since under the conditions tested, there was a sensitization of GBM cells. However, this effect was restricted to the resistant cell line (T98G cells). Thus, it should be considered the genetic characteristics of each GBM cell line, since these are crucial to the cellular responses to the conditions tested in the present work.

O glioblastoma (GBM) é um tumor extremamente agressivo e resistente aos tratamentos convencionais. Os agentes utilizados na quimio- e radioterapia são indutores de danos no DNA, por induzirem quebras de fita simples (SSBs) e quebras de fita dupla (DSBs), as quais são letais para as células, mas quando eficientemente reparadas pelas células tumorais tornam estas resistentes. As principais vias de reparo de DSBs são: a via por recombinação homológa (Homologous Recombination HR) e por recombinação não- homóloga (Non-homologous end joining NHEJ). As proteínas de reparo participantes dessas vias têm sido estudadas como potenciais alvos moleculares na terapia contra o câncer. A estratégia empregada no presente trabalho foi a de inibir a via de reparo HR em células já comprometidas para a via NHEJ. Para isso foi utilizado o inibidor de RAD51 (uma das principais proteínas da via HR), 3-chloro-1-(3,4-dichlorophenyl)-4- morpholinylo-1H-pyrrole-2,5-dione, conhecido como RI-1(Calbiochem), testado em células de glioma M059J e M059K (deficientes e proficientes para DNA-PK, respectivamente), irradiadas com raios-X. Diferentes ensaios foram realizados para o teste com o inibidor RI-1 em células irradiadas ou não e comparados ao controle sem tratamento. Os resultados dos ensaios de sobrevivência clonogênica mostraram que a concentração de 40 M do inibidor RI-1 exerceu um maior efeito inibitório sobre a capacidade de as células se dividirem e formarem colônias. O RI-1 induziu alterações significativas na cinética do ciclo celular predominantemente na linhagem selvagem M059K, nos tempos de 24 e 72 h. Apesar de a linhagem M059J não mostrar alterações significativas na cinética do ciclo celular, esta demonstrou sensibilidade à irradiação, conforme demonstrado pela cinética de reparo das DSBs, sendo mais lenta em relação à M059K, demonstrando o comprometimento do reparo NHEJ na linhagem mutante para DNA-PK. A expressão das proteínas LIG3, XRCC1 e PARP-1 foram analisadas no tempo de 15 minutos e 24 h após a irradiação. Na presença do inibidor RI-1, a expressão da LIG3 foi aumentada em células M059K (15 min e 24 h) comparadas ao grupo controle. Já a linhagem M059J apresentou uma elevada expressão das proteínas XRCC1 e PARP-1 apenas em 15 min em relação ao controle; esses dados indicaram que um possível reparo de DSBs envolvendo essas proteínas pode ter sido ativado logo nos primeiros minutos após a indução de danos nessas células. O conjunto dos resultados deste trabalho sugere um papel atuante do inibidor RI-1 em células comprometidas para o reparo NHEJ, isto é, a linhagem M059J, levando à sugestão de que vias alternativas de reparo podem possivelmente estar envolvidas na resistência das células tumorais aos tratamentos convencionais. / Glioblastoma (GBM) is an extremely aggressive and resistant tumor to conventional treatments. The agents used in chemotherapy and radiotherapy are inducers of DNA damage, since they induce single strand breaks (SSBs) and doublestrand breaks (DSBs), which are lethal to cells, but when efficiently repaired by tumor cells make them resistant to antitumoral agents. The main repair pathways for DSBs are the homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ) pathways. Proteins participating in these processes have been studied as potential molecular targets in cancer therapy. Thus, the strategy employed in this work involved the inhibition of HR repair pathway in cells already committed to the NHEJ pathway, aiming to sensitize irradiated GBM cells. An inhibitor of RAD51 (one of the major HR proteins) was used: 3-chloro-1-(3,4-dichlorophenyl) -4 morpholinylo-1Hpyrrole- 2,5-dione, known as RI-1 (Calbiochem); this compound was tested in GBM cells, M059K and M059J (proficient and deficient for the DNA-PK, respectively) irradiated with X-rays. Various assays were performed to test the inhibitory property of RI-1 in irradiated cells and the combination of the inhibitor with X-irradiation, compared with the untreated control. The results of clonogenic survival showed that 40 M of RI-1 inhibitor exerted a higher inhibitory effect on the ability of cells to divide and form colonies. The RI-1 induced changes in cell cycle kinetics predominantly in the wild-type M059K, at 24 and 72 h. Although M059J did not show significant changes in cell cycle kinetics, these cells showed sensitivity to X-irradiation, as shown by the kinetics of DSB repair (gamma-H2AX foci), which was slower compared to M059K, demonstrating the commitment of the NHEJ repair in M059J (mutant for DNA-PK). The expression of LIG3, PARP-1 and XRCC1 proteins were analyzed at 15 min. and 24 h after irradiation. In the presence of the inhibitor RI-1, LIG 3 expression was increased in M059K cells (15 min. and 24 h) compared to the control group. M059J cells showed a high expression of XRCC1 and PARP-1 only at 15 min., compared to the control. These data indicated that a possible repair of DSBs involving these proteins may have been activated in the first minutes after DNA damage induction. The overall results of this study suggest that RI-1 inhibitor was efficient to influence cellular responses in cells committed to the NHEJ repair, i.e. M059J cell line, leading to the hypothesis that alternative repair pathways may be possibly involved in the resistance of tumor cells.

O glioblastoma (GBM) é um tumor extremamente agressivo e resistente aos tratamentos convencionais. Os agentes utilizados na quimio- e radioterapia são indutores de danos no DNA, por induzirem quebras de fita simples (SSBs) e quebras de fita dupla (DSBs), as quais são letais para as células, mas quando eficientemente reparadas pelas células tumorais tornam estas resistentes. As principais vias de reparo de DSBs são: a via por recombinação homológa (Homologous Recombination HR) e por recombinação não- homóloga (Non-homologous end joining NHEJ). As proteínas de reparo participantes dessas vias têm sido estudadas como potenciais alvos moleculares na terapia contra o câncer. A estratégia empregada no presente trabalho foi a de inibir a via de reparo HR em células já comprometidas para a via NHEJ. Para isso foi utilizado o inibidor de RAD51 (uma das principais proteínas da via HR), 3-chloro-1-(3,4-dichlorophenyl)-4- morpholinylo-1H-pyrrole-2,5-dione, conhecido como RI-1(Calbiochem), testado em células de glioma M059J e M059K (deficientes e proficientes para DNA-PK, respectivamente), irradiadas com raios-X. Diferentes ensaios foram realizados para o teste com o inibidor RI-1 em células irradiadas ou não e comparados ao controle sem tratamento. Os resultados dos ensaios de sobrevivência clonogênica mostraram que a concentração de 40 M do inibidor RI-1 exerceu um maior efeito inibitório sobre a capacidade de as células se dividirem e formarem colônias. O RI-1 induziu alterações significativas na cinética do ciclo celular predominantemente na linhagem selvagem M059K, nos tempos de 24 e 72 h. Apesar de a linhagem M059J não mostrar alterações significativas na cinética do ciclo celular, esta demonstrou sensibilidade à irradiação, conforme demonstrado pela cinética de reparo das DSBs, sendo mais lenta em relação à M059K, demonstrando o comprometimento do reparo NHEJ na linhagem mutante para DNA-PK. A expressão das proteínas LIG3, XRCC1 e PARP-1 foram analisadas no tempo de 15 minutos e 24 h após a irradiação. Na presença do inibidor RI-1, a expressão da LIG3 foi aumentada em células M059K (15 min e 24 h) comparadas ao grupo controle. Já a linhagem M059J apresentou uma elevada expressão das proteínas XRCC1 e PARP-1 apenas em 15 min em relação ao controle; esses dados indicaram que um possível reparo de DSBs envolvendo essas proteínas pode ter sido ativado logo nos primeiros minutos após a indução de danos nessas células. O conjunto dos resultados deste trabalho sugere um papel atuante do inibidor RI-1 em células comprometidas para o reparo NHEJ, isto é, a linhagem M059J, levando à sugestão de que vias alternativas de reparo podem possivelmente estar envolvidas na resistência das células tumorais aos tratamentos convencionais. / Glioblastoma (GBM) is an extremely aggressive and resistant tumor to conventional treatments. The agents used in chemotherapy and radiotherapy are inducers of DNA damage, since they induce single strand breaks (SSBs) and doublestrand breaks (DSBs), which are lethal to cells, but when efficiently repaired by tumor cells make them resistant to antitumoral agents. The main repair pathways for DSBs are the homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ) pathways. Proteins participating in these processes have been studied as potential molecular targets in cancer therapy. Thus, the strategy employed in this work involved the inhibition of HR repair pathway in cells already committed to the NHEJ pathway, aiming to sensitize irradiated GBM cells. An inhibitor of RAD51 (one of the major HR proteins) was used: 3-chloro-1-(3,4-dichlorophenyl) -4 morpholinylo-1Hpyrrole- 2,5-dione, known as RI-1 (Calbiochem); this compound was tested in GBM cells, M059K and M059J (proficient and deficient for the DNA-PK, respectively) irradiated with X-rays. Various assays were performed to test the inhibitory property of RI-1 in irradiated cells and the combination of the inhibitor with X-irradiation, compared with the untreated control. The results of clonogenic survival showed that 40 M of RI-1 inhibitor exerted a higher inhibitory effect on the ability of cells to divide and form colonies. The RI-1 induced changes in cell cycle kinetics predominantly in the wild-type M059K, at 24 and 72 h. Although M059J did not show significant changes in cell cycle kinetics, these cells showed sensitivity to X-irradiation, as shown by the kinetics of DSB repair (gamma-H2AX foci), which was slower compared to M059K, demonstrating the commitment of the NHEJ repair in M059J (mutant for DNA-PK). The expression of LIG3, PARP-1 and XRCC1 proteins were analyzed at 15 min. and 24 h after irradiation. In the presence of the inhibitor RI-1, LIG 3 expression was increased in M059K cells (15 min. and 24 h) compared to the control group. M059J cells showed a high expression of XRCC1 and PARP-1 only at 15 min., compared to the control. These data indicated that a possible repair of DSBs involving these proteins may have been activated in the first minutes after DNA damage induction. The overall results of this study suggest that RI-1 inhibitor was efficient to influence cellular responses in cells committed to the NHEJ repair, i.e. M059J cell line, leading to the hypothesis that alternative repair pathways may be possibly involved in the resistance of tumor cells.