As proteínas E2 promoter binding factor (E2F) estão presentes em quase todos os organismos eucarióticos e são essenciais para o controle de muitos processos celulares, como a progressão do ciclo celular, divisão celular, replicação do DNA, e apoptose. A família E2F compreende dois tipos diferentes de proteínas: os E2F típicos e os E2F atípicos, que diferem estruturalmente e possuem funções específicas. Desde a descoberta desta família gênica muitos estudos focaram nos seus aspectos funcionais, porém a história evolutiva desta família gênica estava fracamente entendida em plantas. Nossas descobertas sugerem que os E2F típicos são mais similares a proteína ancestral que os E2F atípicos (DEL). As proteínas E2F surgiram logo após a emergência das espécies eucarióticas, enquanto as proteínas DEL parecem ter surgido antes da separação entre fungos, metazoários e plantas. As proteínas DEL provavelmente emergiram por uma duplicação parcial do gene que codificava a proteína E2F ancestral. Nossos dados também sugerem que a divergência entre E2Fs ativadores e repressores emergiu duas vezes durante a evolução, uma na linhagem embriófita de plantas e outra na linhagem metazoária. Os E2Fs típicos possuem membros que são reguladores positivos para os seus genes alvo e dados recentes estabeleceram um link entre a resposta a danos ao DNA e genes E2F específicos em células de mamíferos, porém o envolvimento da família genica E2F na sinalização ao reparo de DNA em plantas ainda permanece desconhecido. Nós estudamos o envolvimento dos genes E2F em resposta a dano genotóxico em plantas de arroz e Arabidopsis thaliana. Foram conduzidos experimentos com plântulas de arroz e arabidopsis usando UV-B e MMS (Methyl Methanesulfonate) como fonte de danos genotóxicos. Em resposta a estes estresses E2F ativadores específicos aumentaram sua expressão relativa quando comparados com plantas em condições controle. Os resultados obtidos nos experimentos de estresse genotóxicos nos levaram a sugerir que membros específicos da família E2F de arroz e arabidopsis estão envolvidos com as respostas ao dano de DNA. / The E2 promoter binding factor (E2F) proteins are present in almost all eukaryotic organisms and are essential to control several cellular processes, such as the cell cycle progression, cell division, DNA replication, and apoptosis. The E2F family comprises two different types of proteins: the typical E2Fs and atypical E2Fs, which differ structurally and have specific functions. Since the discovery of this gene family several studies have focused on the functional aspects, but the evolutionary history of this gene family was poorly understood in plants. Our findings suggest that typical E2F is more similar to the ancestral protein than atypical E2F (DEL). The E2F proteins arose early after the emergence of the eukaryotic species, while DEL proteins appear to have arisen after the separation of fungi, metazoan and plants. The DEL proteins probably emerged through a partial duplication from the gene that encodes the ancient E2F protein. Our data also suggest that the divergence of the E2Fs between activators and repressors emerged twice during evolution, once in the embryophyte lineage and another in the metazoan lineage. The typical E2Fs has members that are positive regulators for their target genes and recent data have established a link between response to DNA damage and specific E2F genes in mammalian cells, but the involvement of the E2F gene family in the signaling of DNA repair in plants still unknown. We studied the involvement of E2F genes in response to genotoxic damage in rice and Arabidopsis thaliana plants. Experiments were conducted with rice and A. thaliana plantlets using UV-B and MMS (Methyl Methanesulfonate) as genotoxic damage souce. In response to these stresses specific activator E2F genes increased their relative expression compared to plants in control condition. The results obtained in the genotoxic stress experiments lead us to suggest that specific members of the E2F family of rice and arabidopsis are involved with responses to DNA damage.

SOMBRA, Carla Maria Lima. Biomonitoramento genotóxico e genético como indicador de risco à saúde por exposição ao urânio de residentes dos municípios de Monte Alegre, Prainha e Alenquer no estado do Pará. 2009. 96 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-07T15:26:51Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_cmlsombra.pdf: 1392819 bytes, checksum: 8fd513bea0a95bdd949d552162270985 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-08T11:26:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_cmlsombra.pdf: 1392819 bytes, checksum: 8fd513bea0a95bdd949d552162270985 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-08T11:26:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_cmlsombra.pdf: 1392819 bytes, checksum: 8fd513bea0a95bdd949d552162270985 (MD5) Previous issue date: 2009 / Radiation is considered a risk factor for the development of several types of cancers caused by damage into the DNA molecule and is of extreme importance, therefore, the monitoring of human populations exposed to it. The municipality of Monte Alegre in the state of Pará in Brazil has one of the largest uranium mining areas of the world, which extends to the neighboring municipalities of Prainha and Alenquer. This work assessed the genotoxic potential of exposure to uranium in rocks found in dwellings in individuals from the municipalities of Monte Alegre, Prainha and Alenquer through the alkaline comet assay in peripheral blood lymphocytes and the determination of the frequencies of polymorphisms in DNA repair genes XRCC1 and XRCC3 and in carcinogen-metabolism gene GSTM1 through direct DNA sequencing. The analysis of the alkaline comet assay indicated that there was no statistically significant difference between the Damage Indexes (DIs) of Monte Alegre (DI = 32.01 ± 1.57), Prainha (DI = 45.80 ± 1.12) and Alenquer (DI = 44.30 ± 0.62) and of the negative control (DI = 42.00 ± 5.75) (p > 0.05). Through direct DNA sequencing, there were polymorphisms in XRCC1 and XRCC3 genes in regions of introns and exons. In XRCC1 gene, the variant allele frequencies for Arg194Trp polymorphism in Monte Alegre, Prainha and Alenquer populations were 12%, 13% and 7%, and for Arg399Gln, 28%, 30% and 32% respectively. In XRCC3 gene, the frequencies of the variant allele of Thr241Met polymorphism found in Monte Alegre, Prainha and Alenquer populations were, respectively, 28%, 13% and 33%. For GSTM1 gene, the frequencies obtained for the absence of this gene were 36%, 31% and 40%, respectively to Monte Alegre, Prainha and Alenquer populations. In general, the absence frequencies of GSTM1 gene and of allelic frequencies in XRCC1 and XRCC3 exons were statistically similar among the three municipalities and were in agreement with frequencies obtained in other studies with Brazilian populations. As a conclusion, among the populations studied, there was no increased incidence of DNA damage by exposure to uranium, which can be explained by the low radiation in these locations and that the allelic frequencies of polymorphisms found in the DNA repair genes XRCC1 and XRCC3, and the absence frequencies of GSTM1 gene did not differ from those in populations from other regions of Brazil. Thus, in the studied area, possibly there is no tendency to the development of cancer induced by exposure to uranium. / A radiação ionizante é considerada um fator de risco para o desenvolvimento de diversos tipos de neoplasias pelos danos causados à molécula de DNA, sendo de extrema importância, portanto, o monitoramento de populações humanas expostas a ela. O município de Monte Alegre no estado do Pará apresenta uma das maiores áreas de mineração do urânio do mundo, que se estende aos municípios vizinhos de Prainha e Alenquer. Este trabalho teve como objetivos a avaliação do potencial genotóxico do urânio presente em rochas nas residências de indivíduos dos municípios de Monte Alegre, Prainha e Alenquer através do ensaio do cometa alcalino em linfócitos periféricos e a determinação das freqüências de polimorfismos nos genes de reparo do DNA XRCC1 e XRCC3 e no gene de metabolização GSTM1 através de seqüenciamento direto de DNA. Na análise do cometa alcalino, não houve diferença estatisticamente significante entre os Índices de Dano (IDs) das populações de Monte Alegre (ID = 32,01 ± 1,57), Prainha (ID = 45,80 ± 1,12) e Alenquer (ID = 44,30 ± 0,62) e o do controle negativo (ID = 42,00 ± 5,75) (p > 0,05). Através do seqüenciamento direto de DNA, observou-se a presença de polimorfismos nos genes XRCC1 e XRCC3 em regiões de íntrons e de éxons. No gene XRCC1, as freqüências alélicas variantes para o polimorfismo Arg194Trp nas populações de Monte Alegre, Prainha e Alenquer foram 12%, 13% e 7% e, para Arg399Gln, 28%, 30% e 32%, respectivamente. No gene XRCC3, as freqüências do alelo variante do polimorfismo Thr241Met encontradas nas populações de Monte Alegre, Prainha e Alenquer foram, respectivamente, 28%, 13% e 33%. Em relação ao gene GSTM1, as freqüências obtidas de ausência do gene apresentaram os valores de 36%, 31% e 40%, respectivamente às populações de Monte Alegre, Prainha e Alenquer. No geral, todas as freqüências alélicas nos éxons dos genes XRCC1 e XRCC3 e de ausência do gene GSTM1 foram estatisticamente semelhantes entre os três municípios e se mostraram em concordância com freqüências obtidas em outros estudos com populações brasileiras. Conclui-se que, dentre as populações estudadas, não houve aumento da incidência de dano ao DNA pela exposição ao urânio, o que pode se explicar pela baixa radiação nessas localidades. Além disso, as freqüências alélicas dos polimorfismos encontrados nos genes de reparo XRCC1 e XRCC3, assim como as de ausência do gene de metabolização GSTM1 não diferiram das encontradas em populações de outras regiões do Brasil. Desse modo, nas regiões estudadas, possivelmente não existe tendência ao desenvolvimento de câncer induzido pela exposição ao urânio.

BARROS, Francisco Washington Araújo. Estudo do potencial anticâncer de novos derivados acridínicos sintéticos em modelos experimentais in vitro. 2010. 139 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-27T13:36:44Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_fwabarros.pdf: 13241178 bytes, checksum: e06546c078af5823915b1be26bf86536 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-27T15:59:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_fwabarros.pdf: 13241178 bytes, checksum: e06546c078af5823915b1be26bf86536 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-27T15:59:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_fwabarros.pdf: 13241178 bytes, checksum: e06546c078af5823915b1be26bf86536 (MD5) Previous issue date: 2010 / Acridines are planar aromatic polycyclic molecules that have the ability to progress in nuclear DNA. Many of its representatives have antibacterial, antiparasitic and antitumor. This study evaluated the cytotoxic potential of 22 new acridine compounds in strains of human tumor cells. Among these, four compounds [5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-methyl-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC4; 5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-bromine-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC7; 5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-chloro-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC10; and 5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-fluor-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC23] were active, especially in HCT-8 (colon) and SF-296 (glioblastoma), with IC50 values ranging from 2.3 to 5.3 mg / mL. The compounds were selective for tumor cells, provided they do not inhibit (IC50 > 25 µg/mL) cell proliferation monocucleares human peripheral blood (CMSPH) and were not able to induce DNA damage to these cells. None of the compounds showed hemolytic activity against erythrocytes of mice (EC50 > 200 µg/mL), suggesting a cytotoxicity by more specific mechanisms. In order to determine the mechanism involved in the selective cytotoxicity of compounds was carried out a sequence of in vitro experiments, using the line HCT-8 as a model. The cells were treated in different concentrations of compounds (2.5, 5 and 10 µg/mL) for 12 and 24 hours. All compounds were able to reduce the viability test (trypan blue) and proliferation (BrdU assay) of HCT-8 cells after treatment. Induction of apoptosis by acridine derivatives was determined by flow cytometry (membrane integrity, DNA fragmentation and internucleosomal transmembrane potential) and morphological analysis of cellular changes (ethidium bromide/acridine orange, and hematoxylin-eosin). The analysis by flow cytometry showed that the compounds evaluated promoted mitochondrial depolarization, which shows the activation of apoptosis by intrinsic pathway in HCT-8 cells. In the analysis of screening in 3 different mutant strains of Saccharomyces cerevisiae, it was observed that the line Top1Δ (without topoisomerase I) showed resistance to acridine compounds tested at a concentration of 50 µg/mL. In addition, the acridines partially inhibited the relaxation of DNA by topoisomerase I, suggesting that the compounds AC4, AC7, AC10, AC23 has the potential antiproliferative partly related to inhibition of catalytic activity of this enzyme. These data indicate the potential anticancer compounds tested. / Acridinas são moléculas policíclicas aromáticas planares que possuem a capacidade de intercalar no DNA nuclear. Muitos dos seus representantes apresentam propriedades antibacterianas, antiparasitárias e antitumorais. O presente estudo avaliou o potencial citotóxico de 22 novos compostos acridínicos em linhagens de células tumorais humanas. Dentre esses, quatro compostos [5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-metil-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC4; 5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC7; 5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC10; e 5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC23] foram ativos, especialmente em HCT-8 (cólon) e SF-296 (glioblastoma), com valores de CI50 variando de 2,3 a 5,3 µg/mL. Os compostos apresentaram seletividade para células tumorais, desde que não inibiram (IC50 > 25 µg/mL) a proliferação de células monocucleares de sangue periférico humano (CMSPH), bem como, não foram capazes de induzir dano ao DNA dessas células. Nenhum dos compostos mostrou atividade hemolítica contra eritrócitos de camundongos (EC50 > 200 µg/mL), o que sugere uma citotoxicidade por mecanismos mais específicos. A fim de determinar o mecanismo envolvido na citotoxicidade seletiva dos compostos, foi realizada uma seqüência de experimentos in vitro, usando a linhagem HCT-8 como modelo. As células foram tratadas em diferentes concentrações dos compostos (2,5; 5 e 10 µg/mL) por 12 e 24 horas. Todos os compostos foram capazes de reduzir a viabilidade (teste do azul de tripan) e a proliferação (ensaio do BrdU) de células HCT-8 após o tratamento. A indução de apoptose pelos derivados acridínicos foi determinada por citometria de fluxo (integridade da membrana, fragmentação do DNA internucleosomal e potencial transmembrânico) e por análise morfológica das alterações celulares (brometo de etídeo/laranja de acridina e hematoxilina/eosina). A análise por citometria de fluxo revelou que os compostos avaliados promoveram despolarização mitocondrial, o qual evidencia a ativação da apoptose pela via intrínseca nas células HCT-8. Na análise do screening em 3 diferentes linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae, foi observado que a linhagem Top1Δ (sem topoisomerase I) mostrou moderada resistência aos compostos acridínicos testados na concentração de 50 µg/mL. Além disso, as acridinas inibiram parcialmente o relaxamento do DNA por topoisomerase I, sugerindo que os compostos AC4, AC7, AC10, AC23 tem o potencial antiproliferativo, em parte, relacionado a inibição da atividade catalítica desta enzima. Esses dados apontam o potencial anticâncer dos compostos testados.

As proteínas E2 promoter binding factor (E2F) estão presentes em quase todos os organismos eucarióticos e são essenciais para o controle de muitos processos celulares, como a progressão do ciclo celular, divisão celular, replicação do DNA, e apoptose. A família E2F compreende dois tipos diferentes de proteínas: os E2F típicos e os E2F atípicos, que diferem estruturalmente e possuem funções específicas. Desde a descoberta desta família gênica muitos estudos focaram nos seus aspectos funcionais, porém a história evolutiva desta família gênica estava fracamente entendida em plantas. Nossas descobertas sugerem que os E2F típicos são mais similares a proteína ancestral que os E2F atípicos (DEL). As proteínas E2F surgiram logo após a emergência das espécies eucarióticas, enquanto as proteínas DEL parecem ter surgido antes da separação entre fungos, metazoários e plantas. As proteínas DEL provavelmente emergiram por uma duplicação parcial do gene que codificava a proteína E2F ancestral. Nossos dados também sugerem que a divergência entre E2Fs ativadores e repressores emergiu duas vezes durante a evolução, uma na linhagem embriófita de plantas e outra na linhagem metazoária. Os E2Fs típicos possuem membros que são reguladores positivos para os seus genes alvo e dados recentes estabeleceram um link entre a resposta a danos ao DNA e genes E2F específicos em células de mamíferos, porém o envolvimento da família genica E2F na sinalização ao reparo de DNA em plantas ainda permanece desconhecido. Nós estudamos o envolvimento dos genes E2F em resposta a dano genotóxico em plantas de arroz e Arabidopsis thaliana. Foram conduzidos experimentos com plântulas de arroz e arabidopsis usando UV-B e MMS (Methyl Methanesulfonate) como fonte de danos genotóxicos. Em resposta a estes estresses E2F ativadores específicos aumentaram sua expressão relativa quando comparados com plantas em condições controle. Os resultados obtidos nos experimentos de estresse genotóxicos nos levaram a sugerir que membros específicos da família E2F de arroz e arabidopsis estão envolvidos com as respostas ao dano de DNA. / The E2 promoter binding factor (E2F) proteins are present in almost all eukaryotic organisms and are essential to control several cellular processes, such as the cell cycle progression, cell division, DNA replication, and apoptosis. The E2F family comprises two different types of proteins: the typical E2Fs and atypical E2Fs, which differ structurally and have specific functions. Since the discovery of this gene family several studies have focused on the functional aspects, but the evolutionary history of this gene family was poorly understood in plants. Our findings suggest that typical E2F is more similar to the ancestral protein than atypical E2F (DEL). The E2F proteins arose early after the emergence of the eukaryotic species, while DEL proteins appear to have arisen after the separation of fungi, metazoan and plants. The DEL proteins probably emerged through a partial duplication from the gene that encodes the ancient E2F protein. Our data also suggest that the divergence of the E2Fs between activators and repressors emerged twice during evolution, once in the embryophyte lineage and another in the metazoan lineage. The typical E2Fs has members that are positive regulators for their target genes and recent data have established a link between response to DNA damage and specific E2F genes in mammalian cells, but the involvement of the E2F gene family in the signaling of DNA repair in plants still unknown. We studied the involvement of E2F genes in response to genotoxic damage in rice and Arabidopsis thaliana plants. Experiments were conducted with rice and A. thaliana plantlets using UV-B and MMS (Methyl Methanesulfonate) as genotoxic damage souce. In response to these stresses specific activator E2F genes increased their relative expression compared to plants in control condition. The results obtained in the genotoxic stress experiments lead us to suggest that specific members of the E2F family of rice and arabidopsis are involved with responses to DNA damage.

As proteínas E2 promoter binding factor (E2F) estão presentes em quase todos os organismos eucarióticos e são essenciais para o controle de muitos processos celulares, como a progressão do ciclo celular, divisão celular, replicação do DNA, e apoptose. A família E2F compreende dois tipos diferentes de proteínas: os E2F típicos e os E2F atípicos, que diferem estruturalmente e possuem funções específicas. Desde a descoberta desta família gênica muitos estudos focaram nos seus aspectos funcionais, porém a história evolutiva desta família gênica estava fracamente entendida em plantas. Nossas descobertas sugerem que os E2F típicos são mais similares a proteína ancestral que os E2F atípicos (DEL). As proteínas E2F surgiram logo após a emergência das espécies eucarióticas, enquanto as proteínas DEL parecem ter surgido antes da separação entre fungos, metazoários e plantas. As proteínas DEL provavelmente emergiram por uma duplicação parcial do gene que codificava a proteína E2F ancestral. Nossos dados também sugerem que a divergência entre E2Fs ativadores e repressores emergiu duas vezes durante a evolução, uma na linhagem embriófita de plantas e outra na linhagem metazoária. Os E2Fs típicos possuem membros que são reguladores positivos para os seus genes alvo e dados recentes estabeleceram um link entre a resposta a danos ao DNA e genes E2F específicos em células de mamíferos, porém o envolvimento da família genica E2F na sinalização ao reparo de DNA em plantas ainda permanece desconhecido. Nós estudamos o envolvimento dos genes E2F em resposta a dano genotóxico em plantas de arroz e Arabidopsis thaliana. Foram conduzidos experimentos com plântulas de arroz e arabidopsis usando UV-B e MMS (Methyl Methanesulfonate) como fonte de danos genotóxicos. Em resposta a estes estresses E2F ativadores específicos aumentaram sua expressão relativa quando comparados com plantas em condições controle. Os resultados obtidos nos experimentos de estresse genotóxicos nos levaram a sugerir que membros específicos da família E2F de arroz e arabidopsis estão envolvidos com as respostas ao dano de DNA. / The E2 promoter binding factor (E2F) proteins are present in almost all eukaryotic organisms and are essential to control several cellular processes, such as the cell cycle progression, cell division, DNA replication, and apoptosis. The E2F family comprises two different types of proteins: the typical E2Fs and atypical E2Fs, which differ structurally and have specific functions. Since the discovery of this gene family several studies have focused on the functional aspects, but the evolutionary history of this gene family was poorly understood in plants. Our findings suggest that typical E2F is more similar to the ancestral protein than atypical E2F (DEL). The E2F proteins arose early after the emergence of the eukaryotic species, while DEL proteins appear to have arisen after the separation of fungi, metazoan and plants. The DEL proteins probably emerged through a partial duplication from the gene that encodes the ancient E2F protein. Our data also suggest that the divergence of the E2Fs between activators and repressors emerged twice during evolution, once in the embryophyte lineage and another in the metazoan lineage. The typical E2Fs has members that are positive regulators for their target genes and recent data have established a link between response to DNA damage and specific E2F genes in mammalian cells, but the involvement of the E2F gene family in the signaling of DNA repair in plants still unknown. We studied the involvement of E2F genes in response to genotoxic damage in rice and Arabidopsis thaliana plants. Experiments were conducted with rice and A. thaliana plantlets using UV-B and MMS (Methyl Methanesulfonate) as genotoxic damage souce. In response to these stresses specific activator E2F genes increased their relative expression compared to plants in control condition. The results obtained in the genotoxic stress experiments lead us to suggest that specific members of the E2F family of rice and arabidopsis are involved with responses to DNA damage.

Nek1 é uma serina/treonina quinase humana envolvida na ciliogênese, na resposta a danos ao DNA e na regulação do ciclo celular. Devido ao possível envolvimento dessa proteína em patologias como a Doença Policística do Rim (PKD), a Síndrome de Costelas Curtas e Polidáctilia tipo Majewski e no desenvolvimento de tumores, muitos estudos tem sido feitos buscando entender a via de atuação dessa quinase nas células. Em vista disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da Nek1 em resposta a danos ao DNA, principalmente gerados por agentes indutores de Crosslinks (ICLs), como cisplatina, buscando localizar a Nek1 nas vias de sinalização conhecidas e identificar proteínas que interagem com essa quinase. Para isto, foi utilizado um modelo de silenciamento estável de Nek1 por shRNAi na linhagem celular humana Hek293t. Essas células, quando comparadas à linhagem selvagem expressando a proteína, apresentaram um reparo deficiente de lesões induzidas por cisplatina e ausência de quebras de dupla fita através do ensaio cometa, confirmado pelos baixos níveis de fosforilação da histona H2AX. Entretanto, análises com outro agente indutor de ICLs, Nimustina (ACNU), demonstrou que a Nek1 parece atuar nos mecanismos envolvidos no reparo de lesões induzidas por cisplatina. Isso sugere que essa proteína possa estar agindo no reconhecimento da lesão do DNA e até mesmo regulando vias checagem de ciclo celular, uma vez que a linhagem silenciada apresentou modificações no ciclo celular e na sinalização de Chk1 e Chk2, após a exposição com cisplatina. Além disso, essas células também apresentaram alterações na sinalização das proteínas envolvidas no reparo de ICLs, BRCA1 e FANCD2. O estudo de interação proteica por espectrometria de massas destacou algumas proteínas de reparo, como proteínas da via de Fanconi, e principalmente moléculas relacionadas com o processo de ubiquitinação, sugerindo que este pode ser o mecanismo pelo qual essa molécula está atuando e integrando diferentes sistemas. Esse conjunto de dados indica o papel da Nek1 como uma proteína sensora de danos que atua no início das vias de reparo, regulando diferentes moléculas e interagindo em distintos processos celulares como controle do ciclo celular, reparo e morte. / Nek1 is a human serine/threonine protein kinase involved in ciliogenesis, DNA damage response and cell cycle regulation. Because of its possible involvement in human diseases such as Polycystic Kidney Disease (PKD), Short-Rib Polydactyly Syndrome Type Majewski and development of tumors, many studies have been done to understand how this kinase acts in cells. Therefore, the objective of this study was to evaluate a role for Nek1 in response to DNA damage, mainly generated by agents that induce crosslinks (ICLs), such as cisplatin, identifying pathways in which participate and how proteins interact with this kinase. To accomplish that, a stable silencing of Nek1 by shRNAi in human cell line Hek293t was employed. These cells, when compared to the wild type, showed a deficient repair of lesions induced by cisplatin and absence of double strand breaks, when analysed by comet assay and, confirmed by low levels of histone H2AX phosphorylation. However, analysis with another inducing ICLs agent, Nimustine (ACNU) demonstrated that Nek1 seems to act on mechanisms involved in repair of lesions induced by cisplatin. It suggesting that this protein might be acting on the recognition of DNA damage and even regulating checkpoint pathways, since the silenced strain showed changes in cell cycle and in signaling of Chk1 and Chk2 after exposure to cisplatin. Moreover, these cells also showed changes in signaling of proteins involved in the repair of ICLs FANCD2 and BRCA1. The study of protein interaction by mass spectrometry highlighted some repair proteins, like Fanconi pathway proteins, and protein involved in the ubiquitin-related process, suggesting a possible mechanism of action and integration with different systems. This dataset indicates the role of Nek1 as a DNA damage sensor protein that acts at the beginning of the repair pathways regulating and interacting with distinct molecules in different cellular processes such as cell cycle control, repair and death.

FARIAS, I. R. Analise da expressão dos genes de reparo da lesão de fita dupla do DNA de trabalhadores rurais expostos a agrotóxicos. 2017. 101 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Ivone Sousa (ppgcm.ufc@gmail.com) on 2017-09-11T14:16:57Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_irfarias.pdf: 2060772 bytes, checksum: d6a3cd5cc4fbd9571605d6446c4af485 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-09-11T16:01:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_irfarias.pdf: 2060772 bytes, checksum: d6a3cd5cc4fbd9571605d6446c4af485 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-11T16:01:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_irfarias.pdf: 2060772 bytes, checksum: d6a3cd5cc4fbd9571605d6446c4af485 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / The need to increase the demand for food produced brought with it an incorporation of technical-scientific development in agriculture and became a justification for the use of some chemicals in order to obtain a higher production through the manipulation of organic factors. The damage caused by high levels of toxicity of pesticides in a greater number of cases of cancers in farmers, making studies of the mechanisms of action involved and the damages that can cause human health of extreme relevance. In order to maintain a genomic integrity and its human stability around 150 genes involved in our DNA repair mechanisms. These errors when a DNA tape (DSBs) can be corrected by two types of mechanism, a Homologous Recombination (HR) and a Joint of Non-Homologous Extremities (NHEJ). Problems in DNA tape repair mechanisms in response to various types of damage caused by exposure to agrochemicals by farmers may trigger the accumulation of genetic genes and / or a deregulation of cell growth, leading to genomic instability and neoplastic development. The aim of the present study was to analyze genetic genetics by genetic cytogenetics by gene expression using the real-time PCR technique using ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6, RAD51 and LIG4 genes, belonging to the double-stranded DNA repair mechanism. This analysis was based on 90 cases of rural workers exposed to pesticides in the region of the Chapada do Apodi, in Limoeiro do Norte, and 10 samples from healthy individuals as control. With this study, it was possible to identify the ATM, LIG4 and XRCC5 genes presented the level of expression significant for a time variable of exposure to agrochemicals and for a variable groups of farmers, the genes LIG4, XRCC5 and XRCC6 presented the level of expression Para as variables Smoke and alcohol levels; expression levels of the XRCC5 and XRCC6 genes were still significant for a variable use of EPIs; the BRCA2 gene presented significance of expression for a variable karyotype; finally, gene XRCC6 a variable type of contact with pesticide. These results support the importance of ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6 and LIG4 genes in the maintenance of genomic stability, promoting a better understanding of the cellular mechanisms influenced by exposure to pesticides. / A necessidade do aumento na demanda de alimentos produzidos trouxe consigo a incorporação do desenvolvimento técnico-científico à agricultura e passou a ser justificativa para a utilização de alguns produtos químicos com o objetivo de obter uma maior produção por meio da manipulação de fatores orgânicos. Os danos que são acarretados devido aos níveis elevados de toxicidade dos agrotóxicos vem sendo uma das maiores causas de cânceres em agricultores, tornando-se de extrema relevância os estudos nos mecanismos de ação envolvidos e os danos que podem vir a causar à saúde humana. Afim de manter a integridade genômica e sua estabilidade os seres humanos possuem em torno de 150 genes envolvidos diretamente nos mecanismos de reparo de DNA. Estes danos quando acometem a dupla fita de DNA (DSBs) podem ser corrigidos por dois tipos de mecanismo, a Recombinação Homóloga (HR) e a Junção de Extremidades Não Homólogas (NHEJ). Problemas nos mecanismos de reparo de dupla fita de DNA como resposta a diversos tipos de danos acarretados pela exposição a agrotóxicos por agricultores pode desencadear o acúmulo de alterações genéticas e/ou a desregulação do crescimento celular, levando à instabilidade genômica e desenvolvimento neoplásico. Portanto, o presente estudo tem por objetivo analisar as alterações genéticas, por citogenética clássica por bandeamento G, e a expressão genica, por meio da técnica de PCR em tempo real, dos genes ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6, RAD51 e LIG4, pertencentes ao mecanismo de reparo de fita dupla do DNA. Essa análise baseou-se em 90 casos de trabalhadores rurais expostos a agrotóxicos da região da Chapada do Apodi, em Limoeiro do Norte, e 10 amostras de indivíduos saudáveis como controle. Com esse estudo, foi possível identificar que: os genes ATM, LIG4 e XRCC5 apresentaram o nível de expressão significativo para a variável tempo de exposição aos agrotóxicos e para a variável grupos de agricultores, os genes LIG4, XRCC5 e XRCC6 apresentaram o nível de expressão significativa para as variáveis fumo e álcool; os níveis de expressão dos genes XRCC5 e XRCC6 foram ainda significativos para a variável uso de EPIs; o gene BRCA2 apresentou significância de expressão para a variável cariótipo, por fim, o gene XRCC6 apresentou nível de expressão significativo para a variável tipo de contato com agrotóxico. Estes resultados suportam a importância dos genes ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6 e LIG4 na manutenção da estabilidade genômica promovendo um melhor entendimento dos mecanismos celulares influenciados pela exposição a agrotóxicos.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As histonas de Trypanosoma cruzi sao bastante divergentes quando comparadas aos demais eucariotos, principalmente na porcao N-terminal, onde ocorrem modificacoes pos traducionais, que sao reconhecidamente essenciais para o controle da expressao genica e da arquitetura da cromatina. Entre estas modificacoes estao as acetilacoes das lisinas 4, 10 e 14 da histona H4 (H4K4ac, H4K10ac e H4K14ac). Nesta tese mostramos que a H4K4ac, que e a modificacao mais abundante, esta enriquecida em areas de cromatina densamente compactada, enquanto H4K10ac e H4K14ac localizam-se em regioes de cromatina menos densa, preferencialmente na interface entre a eucromatina e a heterocromatina. H4K4ac diminui nas formas nao replicativas e H4K14ac H4K14ac aumenta durante G2 e mitose do ciclo de divisao celular das formas replicativas. H4K10ac e H4K14ac aumentam e H4K4ac diminui no reparo de quebras de dupla fita do DNA. Ao mesmo tempo a superexpressao da proteina TcRad51, essencial para o processo de reparo de DNA por recombinacao homologa causa aumento de H4K10ac e H4K14ac. Quando as lisinas 4, 10 e 14 sao substituidas separadamente por argininas (H4K4R, H4K10R e H4K14R) para evitar a acetilacao sao expressas, elas sao incorporadas na cromatina e diminuem os niveis de cada modificacao. A expressao de H4K4R tem uma distribuicao diferente das histonas endogenas e H4K14R causa diminuicao de crescimento, com celulas acumulando na fase de mitose. Os mutantes de H4K10 e H4K14 ainda apresentam maior mortalidade quando submetidos a radiacao ƒ× que causa quebra de dupla fita de DNA. Tambem mostramos que a proteina TcBDF2, uma proteina que contem bromodomineo, reconhece preferencialmente H4K10ac. A funcao da TcBD2 e desconhecida, mas verificamos que ela aumenta apos exposicao dos parasitas a luz UV, sugerindo que esteja participando no reparo de DNA. Esses dados juntos fornecem evidencias de que cada uma das acetilacoes da histona H4 tem um papel distinto no T. cruzi. A acetilacao em K4 estaria envolvida na montagem da xiii cromatina na fase de replicacao. Ja as modificacoes em K10 e K14 estariam envolvidas com processos especificos de remodelagem da cromatina durante os eventos de reparo e eventualmente transcricao do DNA. / The Trypanosoma cruzi histones are very distinct from other eukaryotes, mainly in the N-terminus, where post translational modifications occur, which are essential for gene expression regulation and chromatin architecture. Among these modifications we found that lysines 4, 10 and 14 of H4 histone are acetylated (H4K4ac, and H4K10ac H4K14ac). In this thesis we show that the H4K4ac, which is the most abundant modification, is enriched in densely packed chromatin, while H4K10ac and H4K14ac are located in less dense chromatin, preferentially at the interface between euchromatin and heterochromatin. H4K4ac decreases in trypomastigote, which is the infective and non-dividing form of the parasite whileH4K14ac increases during G2 and mitosis of the cell cycle in replicative forms. H4K10ac and H4K14ac increases during DNA repair of double stranded breaks while H4K4ac decreases after DNA damage. TcRad51, an essential protein in the homologous recombination pathway, when overexpressed, increases the H4K10ac and H4K14ac levels. When the lysines 4, 10 and 14 are individually replaced by arginine (H4K4R, H4K10R and H4K14R) to prevent the acetylation, they are still incorporated into chromatin and decrease the specific modification level. The H4K4R location is different from the endogenous H4K4ac and the H4K14R expression causes growth reduction, with cells accumulating in mitosis. Mutants H4K10R and H4K14R also have high mortality rates after ƒ× irradiation that causes DNA double-stranded breaks. We also showed that TcBDF2 protein contains a bromodomain that recognizes preferentially H4K10ac. Although the TcBD2 function is unknown, it is increased after UV light exposure, suggesting its involvement in DNA repair. These data together provide evidence that each H4 acetylation has a distinct role in T. cruzi. Probably K4 is involved in chromatin assembly during replication while K10 and K14 acetylation appears to be involved in chromatin remodelling during DNA repair and maybe DNA transcription. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

RIBEIRO JÚNIOR, Howard Lopes. Estudo dos genes relacionados a mecanismos de reparo em danos de DNA em síndrome mielodisplásica. 2013. 112 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-05-11T12:37:07Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_hlribeirojunior.pdf: 3080217 bytes, checksum: 33e1aea19b037659818fced9bb3a0a01 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-05-11T12:41:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_hlribeirojunior.pdf: 3080217 bytes, checksum: 33e1aea19b037659818fced9bb3a0a01 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-11T12:41:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_hlribeirojunior.pdf: 3080217 bytes, checksum: 33e1aea19b037659818fced9bb3a0a01 (MD5) Previous issue date: 2013 / Myelodysplastic Syndrome (MDS) is a group of diseases of clonal hematopoietic progenitor cells, characterized by cytopenia (s) peripheral (s), dysplasia of one or more myeloid cell lineages and increased risk for development of acute myeloid leukemia. MDS is considered a disease of older people, because approximately 80% of patients have more than 60 years at diagnosis. Are rare in children, being observed in less than 5% of hematologic malignancies that affect patients under 14 years of age. The pathogenesis of MDS involves DNA damage in hematopoietic stem cells probably affected by Double-Strand Break (DSB) in the process of Non-homologous end join (NHEJ) and homologous recombination (HR) repair mechanisms as key for ensuring genomic stability of cells trunk. This cohort study proposed evaluate the association between rs4793191, rs9567623 and rs1801320 polymorphisms of the BRCA1, BRCA2 and RAD5 genes, acting on the HR mechanism; the rs3835, rs2267437 and rs1805388 of the XRCC5, XRCC6 and LIG4, related with NHEJ mechanism and, finally, ATM rs228593 as molecular sensor damage in DSBs. This genotyping analysis was based on the methodology of PCR-RFLP, between bone marrow samples of 60 patients with MDS, from the University Hospital Walter Cantidio, and 82 peripheral blood samples of elderly healthy volunteers with approval in the CEP / HUWC under protocol No. 027.04.12. The MDS patients were diagnosed by examination of bone marrow and bone marrow cytogenetic analysis technique by G band. The genotypes studied polymorphisms were in Hardy-Weinberg equilibrium (p> 0.05), except for the rs1805388 polymorphism in LIG4 gene. Our results showed for the rs228593 polymorphism of the ATM gene association with low-risk MDS for genotype A /G (p = 0.008, OR 0.225, CI 0.075 to 0.680) with added association of genotype A/G with the clinical variables of cytopenia (p = 0.032, OR 5.250, CI 1.151 to 23.937), in the range of 0-1 in peripheral blood cytopenias, and with favorable prognosis in IPSS (p <0.001, OR 21.95, CI 29.791 to 16.185). For the rs2267437 polymorphism in the gene XRCC6 relate the mutant genotype C / C and G / G + G / G with variable marrow cellularity in the range of normocellular + hypercellular (p = 0.023, OR 5.556 CI 1.270 to 24.239). For the genotypes of rs3835 polymorphism of the XRCC5 gene identify the genotype A / G is highly associated with low-risk MDS (p <0.001, OR 0.100, CI 0.035 to 0.289). Additionally, for the rs1801320 polymorphism of the gene RAD51, we associate the mutant heterozygous genotype G/C with low-risk MDS (p = 0.053, OR 0.453, CI 0.203 to 1.009). For the same polymorphism, we associate the wild genotype G / G with variable age (p <0.001, OR 24.521, CI 64.033 to 93.907), in the range of greater than 60 years old, and with the variable cytopenia (0-1 cytopenias) (p <0.001, OR 16.099, CI 31.299 to 82.808). We did not obtain significant association between polymorphisms rs 4793191, rs9567623 and rs1805388 for the genes BRCA1, BRCA2 and LIG4, respectively, and clinical variables for patients with MDS. In this study we demonstrate that genes related to DSB are also related to the pathogenesis of MDS. These results support the importance of polymorphisms rs228592, rs3835, rs2267437 and rs1801320 in the ATM, XRCC5, XRCC6 and RAD51 genes, respectively, in the maintenance of genomic stability by promoting a better understanding of the genesis and etiology of myelodisplastic syndrome. / A Síndrome Mielodisplásica (SMD) é um grupo de doenças clonais das células progenitoras hematopoiéticas, caracterizadas por citopenia(s) periférica(s), displasia de uma ou mais linhagens celulares mielóides e aumento do risco de desenvolvimento de leucemia mielóide aguda. A SMD é considerada uma doença de pessoas idosas, pois aproximadamente 80% dos pacientes possuem mais de 60 anos ao diagnóstico. São raras na infância, sendo observadas em menos de 5% das neoplasias hematológicas que acometem pacientes com menos de 14 anos de idade. A patogênese da SMD envolve danos no DNA nas células tronco hematopoéticas acometido provavelmente pelos danos de fita dupla (DSB) no DNA tendo o processo de junções por extremidades não-homólogas (JENH) e recombinação homóloga como principais mecanismos de reparo necessários para garantir a estabilidade genômica das células-tronco. Este estudo de coorte propôs avaliar a associação dos polimorfismos BRCA1 rs4793191, BRCA2 rs9567623 e RAD51 rs1801320, atuantes no mecanismo de Recombinação Homóloga; o XRCC5 rs3835, XRCC6 rs2267437 e LIG4 rs1805388 relacionados ao mecanismo de Junções por Extremidades não-Homólogas e, por fim, o ATM rs228593, um sensor molecular ao dano em DSB. Esta análise de genotipagem baseou-se na metodologia de PCR-RFLP, entre amostras de medula óssea de 60 pacientes com SMD, oriundos do Hospital Universitário Walter Cantidio, e 82 amostras de sangue periférico de idosos voluntários sadios. Os pacientes com SMD foram diagnosticados de acordo com os critérios propostos pela Organização Mundial de Saúde. Os genótipos dos polimorfismos estudados encontravam-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg (p>0,05), exceto o polimorfismo rs1805388 para o gene LIG4. Nossos resultados apresentaram para o polimorfismo rs228593 do gene ATM uma associação do genótipo heterozigoto A/G (p=0,008, OR 0,225, IC 0,075-0,680) com diminuição de risco para SMD adicionada com associação do genótipo A/G com as variáveis clínicas de citopenia (p=0,032, OR 5,250, IC 1,151-23,937), na faixa de 0-1 citopenias no sangue periférico, e com prognóstico favorável para o índice prognóstico do IPSS (p<0,001, OR 21,95, IC 29,791-16,185). Para o polimorfismo rs2267437 para o gene XRCC6 relacionamos o genótipo mutante C/G e C/G+G/G com a variável celularidade na medula óssea na faixa de normocelular + hipercelular (p=0,023, OR 5,556, IC 1,270-24,239). Para o polimorfismo rs3835 do gene XRCC5 identificamos que o genótipo A/G está altamente associado com a diminuição de risco para SMD (p<0,001, OR 0,100, IC 0,035-0,289). Para o polimorfismo rs1801320 do gene RAD51, associamos o genótipo heterozigoto mutante G/C com diminuição de risco para SMD (p=0,053, OR 0,453, IC 0,203-1,009). Adicionalmente, associamos o genótipo selvagem G/G com a variável idade (p<0,001, OR 24,521, IC 64,033-93,907), na faixa de maior que 60 anos de idade, e com a variável citopenia (0-1 citopenias) (p<0,001, OR 16,099, IC 31,299-82,808). Não obtivemos associação significante entre os polimorfismos rs 4793191, rs9567623 e rs1805388 para os genes BRCA1, BRCA2 e LIG4, respectivamente, e as variáveis clínicas para os pacientes com SMD. Neste estudo demonstramos que os genes relacionados a DSB são também relacionados à patogênese da SMD. Estes resultados suportam a importância dos polimorfismos rs228593, rs3835, rs2267437 e rs1801320 para os genes ATM, XRCC5, XRCC6 e o RAD51, respectivamente, na manutenção da estabilidade genômica promovendo um melhor entendimento da gênese e etiologia da Síndrome Mielodisplásica.

Nek1 é uma serina/treonina quinase humana envolvida na ciliogênese, na resposta a danos ao DNA e na regulação do ciclo celular. Devido ao possível envolvimento dessa proteína em patologias como a Doença Policística do Rim (PKD), a Síndrome de Costelas Curtas e Polidáctilia tipo Majewski e no desenvolvimento de tumores, muitos estudos tem sido feitos buscando entender a via de atuação dessa quinase nas células. Em vista disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da Nek1 em resposta a danos ao DNA, principalmente gerados por agentes indutores de Crosslinks (ICLs), como cisplatina, buscando localizar a Nek1 nas vias de sinalização conhecidas e identificar proteínas que interagem com essa quinase. Para isto, foi utilizado um modelo de silenciamento estável de Nek1 por shRNAi na linhagem celular humana Hek293t. Essas células, quando comparadas à linhagem selvagem expressando a proteína, apresentaram um reparo deficiente de lesões induzidas por cisplatina e ausência de quebras de dupla fita através do ensaio cometa, confirmado pelos baixos níveis de fosforilação da histona H2AX. Entretanto, análises com outro agente indutor de ICLs, Nimustina (ACNU), demonstrou que a Nek1 parece atuar nos mecanismos envolvidos no reparo de lesões induzidas por cisplatina. Isso sugere que essa proteína possa estar agindo no reconhecimento da lesão do DNA e até mesmo regulando vias checagem de ciclo celular, uma vez que a linhagem silenciada apresentou modificações no ciclo celular e na sinalização de Chk1 e Chk2, após a exposição com cisplatina. Além disso, essas células também apresentaram alterações na sinalização das proteínas envolvidas no reparo de ICLs, BRCA1 e FANCD2. O estudo de interação proteica por espectrometria de massas destacou algumas proteínas de reparo, como proteínas da via de Fanconi, e principalmente moléculas relacionadas com o processo de ubiquitinação, sugerindo que este pode ser o mecanismo pelo qual essa molécula está atuando e integrando diferentes sistemas. Esse conjunto de dados indica o papel da Nek1 como uma proteína sensora de danos que atua no início das vias de reparo, regulando diferentes moléculas e interagindo em distintos processos celulares como controle do ciclo celular, reparo e morte. / Nek1 is a human serine/threonine protein kinase involved in ciliogenesis, DNA damage response and cell cycle regulation. Because of its possible involvement in human diseases such as Polycystic Kidney Disease (PKD), Short-Rib Polydactyly Syndrome Type Majewski and development of tumors, many studies have been done to understand how this kinase acts in cells. Therefore, the objective of this study was to evaluate a role for Nek1 in response to DNA damage, mainly generated by agents that induce crosslinks (ICLs), such as cisplatin, identifying pathways in which participate and how proteins interact with this kinase. To accomplish that, a stable silencing of Nek1 by shRNAi in human cell line Hek293t was employed. These cells, when compared to the wild type, showed a deficient repair of lesions induced by cisplatin and absence of double strand breaks, when analysed by comet assay and, confirmed by low levels of histone H2AX phosphorylation. However, analysis with another inducing ICLs agent, Nimustine (ACNU) demonstrated that Nek1 seems to act on mechanisms involved in repair of lesions induced by cisplatin. It suggesting that this protein might be acting on the recognition of DNA damage and even regulating checkpoint pathways, since the silenced strain showed changes in cell cycle and in signaling of Chk1 and Chk2 after exposure to cisplatin. Moreover, these cells also showed changes in signaling of proteins involved in the repair of ICLs FANCD2 and BRCA1. The study of protein interaction by mass spectrometry highlighted some repair proteins, like Fanconi pathway proteins, and protein involved in the ubiquitin-related process, suggesting a possible mechanism of action and integration with different systems. This dataset indicates the role of Nek1 as a DNA damage sensor protein that acts at the beginning of the repair pathways regulating and interacting with distinct molecules in different cellular processes such as cell cycle control, repair and death.